白露 劉靜靜 張歡 何亞飛 劉芳芳 趙瑞娟
(1濮陽醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,河南 濮陽 457000;2鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院)
胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在世界癌癥中排名第三,由于缺乏早期診斷,大多數(shù)胃癌患者被診斷時(shí)已為晚期,臨床上胃癌手術(shù)后治療失敗的最常見原因是原發(fā)性胃癌中游離癌細(xì)胞的播種引起腹膜轉(zhuǎn)移,而且其高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率是胃癌患者低生存率的重要原因〔1〕。研究表明,巨核細(xì)胞白血病因子(MKL)1/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶活性和凋亡抑制因子 (CAAP)1通路參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲和遷移等細(xì)胞惡性生物學(xué)行為過程〔2〕。MKL1在許多組織中廣泛表達(dá),在血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞分化及腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用〔3,4〕。有研究表明,MKL1也可能參與胃癌細(xì)胞增殖〔5〕。CAAP1通過調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)的表達(dá)和活性,被認(rèn)為是凋亡途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子〔6〕。因此,MKL1/CAAP1通路作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)逐漸得到重視。中草藥因毒副作用小和抗腫瘤作用顯著等優(yōu)勢(shì)越來越受到研究者的關(guān)注。香青蘭總黃酮是香青蘭的重要活性成分,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種生物活性〔7〕。但關(guān)于香青蘭總黃酮抗腫瘤活性的研究很少。因此,本研究主要檢測(cè)香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,并探討MKL1/CAAP1通路是否參與這一過程,為研發(fā)胃癌新的治療策略提供參考。
1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及藥物 人胃癌MGC-803細(xì)胞株(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所,批號(hào):CM-1520);香青蘭總黃酮(購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,原料藥,純度98.5%,批號(hào):JL9017-13);曲妥珠單抗(購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司,批號(hào):B3344)。
1.2主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,批號(hào):PM16000044、10270106);四甲基噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒、TRIzol試劑、細(xì)胞蛋白抽提試劑盒、鼠抗人二抗(購(gòu)自美國(guó)Amresco公司,批號(hào):S0793、CA1020、P0033、A2016、L6017);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、MKL1、CAAP1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、Caspase-3和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,批號(hào):DRR019A、RR012A、HZ-048245、HZ-018542、HZ-0684R6、HZ-0611R10、HZ-0742R1);二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(購(gòu)自上海道尚生物科技有限公司,型號(hào):Revco Elite I);酶標(biāo)儀(購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,型號(hào):HBS-1096B);顯微鏡(購(gòu)自日本奧林巴斯公司,型號(hào):CX43);熒光定量PCR儀(購(gòu)自西安天隆科技有限公司,型號(hào):DTC-3G);垂直電泳儀(購(gòu)自北京德元國(guó)際科技有限公司,型號(hào):DYCZ-Mini2);流式細(xì)胞儀、凝膠成像儀(購(gòu)自美國(guó)UVP公司,型號(hào):CytoNova、GelDoc-IT TS3)。
1.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞,待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組,香青蘭總黃酮低、中、高劑量組和曲妥珠單抗組。對(duì)照組不進(jìn)行處理,香青蘭總黃酮低、中、高劑量組分別給予濃度為25、50、100 mg/L的香青蘭總黃酮〔8〕,曲妥珠單抗組給予濃度為10 mg/L的曲妥珠單抗,24 h后收獲細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)〔9〕。
1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 按1.3給予受試物干預(yù)后接種于6孔板中(3 ml/孔),20 h后加入MTT試劑(50 μl/孔),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心棄上清,加入二甲基亞砜,室溫振蕩10 min,用酶標(biāo)儀在630 nm處測(cè)定吸光度值(OD值),計(jì)算細(xì)胞增殖率〔細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%〕。只含有培養(yǎng)基、MTT試劑、二甲基亞砜設(shè)為空白組。
1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按1.3給予受試物干預(yù)后接種于6孔板中(3 ml/孔),24 h后收獲細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液洗滌2次,離心棄上清,分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI,充分混勻后室溫避光孵育20 min,檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
1.6Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 按1.3給予受試物干預(yù)后接種在24孔Transwell小室中,下室加入10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,24 h后取出小室,擦除上室中的細(xì)胞,用甲醛固定,用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min,沖洗干凈后倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)紫色染色的細(xì)胞(侵襲細(xì)胞數(shù))。
1.7細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 按1.3給予受試物干預(yù)后接種于6孔板中(3 ml/孔),待細(xì)胞貼壁后,用100 μl槍頭劃“一”字劃痕,24 h后,顯微鏡下拍照,用圖像分析儀測(cè)量劃痕寬度,計(jì)算遷移距離(遷移距離=0 h時(shí)劃痕寬度-24 h時(shí)劃痕寬度)。
1.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA水平 將細(xì)胞以1×106個(gè)/ml接種于6孔板中(3 ml/孔),按1.3給予受試物干預(yù)24 h后,棄培養(yǎng)基,加入TRIzol進(jìn)行總RNA提取,測(cè)定RNA的濃度和純度,根據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA,制備20 μl反應(yīng)體系,進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,MKL1上游引物為5′-GCGCTGAATCACATGCCAATACAGG-3′,MKL1下游引物為5′-AAGCACTTGGGGGCCGCAGTAGCGCAT-3′;CAAP1上游引物為5′-GGGAGTGAATAACGGGCGAAAAGTA-3′,CAAP1下游引物為5′-TACCTAGGCTGGCTTTTTTATATCA-3′;MMP-2上游引物為5′-CCCTTCAATGGTTGGTACATGG-3′,MMP-2下游引物5′-ACATTGATCTCCGTGACAGCC-3′;Caspase-3上游引物為5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3′,Caspase-3下游引物為5′-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3′;β-actin上游引物為5′-TGCGACTTCAACAGCAACTC-3′,β-actin下游引物為:5′-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3′;采用2-△△Ct法計(jì)算MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(以β-actin作為內(nèi)對(duì)照)。
1.9免疫印跡法檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平 將細(xì)胞以1×106個(gè)/ml接種于6孔板中(3 ml/孔),按1.3給予受試物干預(yù)24 h后,棄培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次,根據(jù)細(xì)胞量加入細(xì)胞蛋白抽提試劑,冰浴裂解2 h,離心取上清,用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h,將膜與MKL1(1∶300)、CAAP1(1∶200)、MMP-2(1∶400)、Caspase-3(1∶300)和β-actin(1∶2 000)抗體進(jìn)行孵育,4℃過夜,室溫條件下加入鼠抗人二抗(稀釋比1∶5 000)孵育30 min。滴加電化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯色,采集圖像,用Image J軟件分析條帶灰度值,以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。
1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。
2.1香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對(duì)照組比較,各香青蘭總黃酮?jiǎng)┝拷M細(xì)胞增殖率顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著增加,呈劑量依賴性,但效果不如曲妥珠單抗組(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。
表1 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖和凋亡的影響
圖1 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響(MTT染色,×200)
圖2 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響
2.2香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與對(duì)照組比較,各香青蘭總黃酮?jiǎng)┝拷M侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移距離顯著降低,呈劑量依賴性,但效果不如曲妥珠單抗組(P<0.05)。見圖3、圖4、表2。
圖3 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)
圖4 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞遷移的影響(×100)
表2 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞侵襲和遷移的影響
2.3香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA水平的影響 與對(duì)照組比較,各香青蘭總黃酮?jiǎng)┝拷M胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA水平顯著降低,呈劑量依賴性,但效果不如曲妥珠單抗組(P<0.05)。見表3。
表3 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3 mRNA水平的影響
2.4香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平的影響 與對(duì)照組比較,各香青蘭總黃酮?jiǎng)┝拷M胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平顯著降低,呈劑量依賴性,但效果不如曲妥珠單抗組(P<0.05)。見表4、圖5。
表4 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平的影響
1~5:對(duì)照組、香青蘭總黃酮低劑量組、香青蘭總黃酮中劑量組、香青蘭總黃酮高劑量組、曲妥珠單抗組圖5 香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1、CAAP1、MMP-2和Caspase-3蛋白水平的影響
胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一,化療仍然是主要的策略。然而,由于缺乏靶向治療,這些傳統(tǒng)化學(xué)物質(zhì)還會(huì)對(duì)正常組織和細(xì)胞造成損傷,導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用和耐藥性〔10〕。因此,從分子水平研究胃癌的病因和發(fā)展機(jī)制,開發(fā)針對(duì)腫瘤靶點(diǎn)的靶向藥物蛋白和信號(hào)通路成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。天然產(chǎn)物中的抗癌化合物因其良好的安全性和多靶點(diǎn)效應(yīng),為腫瘤化療提供了一個(gè)很有前途的選擇〔11〕。本研究首次證明香青蘭總黃酮能有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。曲妥珠單抗被美國(guó)食品與藥品管理局批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性胃癌患者〔12〕。雖然香青蘭總黃酮對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的生物學(xué)作用不如曲妥珠單抗,但考慮到曲妥珠單抗的副作用較多,香青蘭總黃酮還是有進(jìn)一步研究的價(jià)值。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),香青蘭總黃酮能抑制胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1/CAAP1通路的激活。而CAAP1調(diào)節(jié)Caspase-10依賴的線粒體Caspase-3/9反饋擴(kuò)增環(huán)來調(diào)控細(xì)胞凋亡。因此,MKL1/CAAP1通路可能在胃癌MGC-803細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
MKL1是血清反應(yīng)因子(SRF)的轉(zhuǎn)錄共激活因子。SRF通過與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的高度保守的核苷酸序列〔CC(A/T)6GG〕結(jié)合,調(diào)控與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的多種靶基因的表達(dá)〔13〕。研究表明,MKL1參與了多種人類惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制,MKL1通過直接與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6的啟動(dòng)子結(jié)合以增加其表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲〔14〕。此外,MKL1可以促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)化,促進(jìn)細(xì)胞增殖〔4〕。MMP-2和金屬蛋白酶1組織抑制因子(TIMP-1)是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中有兩個(gè)關(guān)鍵因素。有報(bào)道稱,胃癌中上皮細(xì)胞MMP-2的高表達(dá)與低生存率相關(guān),胃癌侵襲性中TIMP-1的低表達(dá)與低生存率相關(guān)。在胃癌中,抑制MMP-2或上調(diào)TIMP-1的表達(dá)均可抑制轉(zhuǎn)移〔15~18〕。在本研究中,香青蘭總黃酮能降低胃癌MGC-803細(xì)胞中MKL1和MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá),成功地抑制了胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。
CAAP1是一種具有強(qiáng)抗凋亡能力的蛋白質(zhì),具有很強(qiáng)的保守型,可以在各種組織中表達(dá)〔19〕。CAAP1干擾Caspase-10的激活,進(jìn)而有效激活線粒體死亡途徑所需的Caspase-3/9反饋放大環(huán)的生成。在細(xì)胞水平上,當(dāng)CAAP1過表達(dá)時(shí)細(xì)胞凋亡水平降低,而當(dāng)CAAP1沉默時(shí)細(xì)胞凋亡水平升高,而腫瘤細(xì)胞過度增殖往往與細(xì)胞凋亡和自噬失衡有關(guān)〔20〕。在本研究中,香青蘭總黃酮能降低胃癌MGC-803細(xì)胞中CAAP1和Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)。因此,MKL1可以靶向CAAP1來抑制胃癌細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)增殖的發(fā)生,這意味著MKL1可以用作胃癌細(xì)胞中的促腫瘤基因。
綜上所述,香青蘭總黃酮可通過抑制胃癌MGC-803細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗癌作用,其機(jī)制可能與MKL1/CAAP1通路的抑制有關(guān),可能為胃癌的治療提供了一種新的策略。