薛藝抒 傅強(qiáng) 包婺平 郝慧娟 張旻

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是以氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑為主要特征的異質(zhì)性疾病，根據(jù)不同內(nèi)型及個(gè)體化治療的目的，可將哮喘分為Type2(T2)型哮喘和非T2型哮喘。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，小氣道功能的異常存在于不同嚴(yán)重程度的哮喘患者[1-3]；我們的臨床研究也發(fā)現(xiàn)小氣道功能異常者的激發(fā)試驗(yàn)陽性率明顯增高[4]。呼吸描記圖末端的減慢被認(rèn)為是與小氣道的氣流阻塞有關(guān)的最早變化，因此，肺功能中的變量，如用力呼氣50%時(shí)的瞬時(shí)流速(Forced expiratory flow at 50% of Forced Vital Capacity[FVC]，F(xiàn)EF50)、用力呼氣75%時(shí)的瞬時(shí)流速(Forced expiratory flow at 75% of FVC，F(xiàn)EF75)和最大呼氣中段流量 (Forced expiratory flow between 25% and 75% FVC，MMEF) 常被用于預(yù)測人類小氣道功能障礙[5]。然而，在動物哮喘模型中哮喘中小氣道功能障礙的觀察和研究仍缺乏。通過建立兩種不同內(nèi)型的哮喘模型，本文檢測小鼠的小氣道功能，并分析其與氣道炎癥、氣道反應(yīng)性、氣道重塑的相關(guān)性，為小氣道功能障礙在動物哮喘模型中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

資料與方法

一、 材料

C57BL/6小鼠(無特殊病原體級，雄性，5～6周齡，體重18～20g)購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物合格證號：SCXK(滬)2017-0012，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心內(nèi)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21℃至25℃，濕度40%至60%，自由喂養(yǎng)水和食物(不含OVA)，采用12小時(shí)為周期的光-暗循環(huán)。所有處理流程和實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動物研究倫理委員會的規(guī)定執(zhí)行(倫理批號: 2019-A011-01)。舒泰50(Virbac S.A., France)，拜特速眠新(拜特生物科技研究所有限公司，長沙)，蘇木素-伊紅染色試劑盒(谷歌生物科技，武漢)；卵清蛋白 ( OVA ) ( grade V&Ⅱ, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo. , USA) ， 小鼠IL-4、IL-5、IL-17A,、TNF-α ELISA試劑盒(ANOGEN, Ontario, Canada)，小鼠IL-13 ELISA試劑盒(Invitrogen, California, USA)。

二、方法

1 兩種內(nèi)型哮喘模型建立

將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只。T2型哮喘模型(OVA組)：在第0天和第7天進(jìn)行卵清蛋白(ovalbumin，OVA)(1mg/kg)+明礬(體積同OVA)腹腔注射致敏小鼠，從第14天至第22天，隔天以PBS配制5% OVA霧化吸入30分鐘，并在休息30分鐘后吸入空氣2小時(shí)；非T2型哮喘模型(OVA+ozone組)：其余操作同OVA組，每次OVA霧化結(jié)束休息30分鐘后，吸入2.5 ppm的臭氧2小時(shí)；對照組(Control組)：在第0天和第7天進(jìn)行PBS腹腔注射，從第14天開始隔天PBS霧化吸入30分鐘，隨后空氣吸入2小時(shí)至第22天。

2 小鼠肺功能檢測

最后一次臭氧暴露后24小時(shí)，以舒泰50(25mg/kg)和拜特速眠新(10mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，確認(rèn)其完全昏睡且痛覺喪失后，將小鼠固定于泡沫操作板上，剪開頸部皮膚后鈍性分離周圍組織，充分暴露氣管，預(yù)先將一生理鹽水浸濕的結(jié)扎線置于氣管下，隨后在甲狀軟骨下的環(huán)狀軟骨上沿氣管橫徑剪一小口，將氣管插管插入氣管中，將結(jié)扎線打結(jié)，固定氣管插管。連接小鼠的氣管插管至EMMS eDacq FM(模擬強(qiáng)迫振蕩)系統(tǒng)體積描記器上的接頭，根據(jù)EMMS數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)eDacq軟件中預(yù)設(shè)的程序，模擬經(jīng)典的臨床肺活量測定法檢測小鼠大、小氣道功能。該系統(tǒng)計(jì)算的參數(shù)包括用力肺活量(Forced Expiratory Volume，F(xiàn)VC)和呼氣中期流量。其中EF50、FEF75、MMEF提示小氣道功能。

3 小鼠氣道反應(yīng)性檢測

隨后進(jìn)行有創(chuàng)的氣道阻力與順應(yīng)性檢測。將小鼠置入EMMS R&C系統(tǒng)的體積描記器中，采用微型通氣系統(tǒng)維持輔助通氣，控制通氣頻率為180次/分，潮氣量為210μl，將氣管插管導(dǎo)管與EMMS R&C系統(tǒng)呼吸流量測定儀和壓力傳感器連接。eDacq軟件自動記錄流速的變化與壓力的變化，并計(jì)算氣道阻力(RL)。與傳感器連接后，待小鼠呼吸平穩(wěn)后通過霧化給藥系統(tǒng)吸入10μl PBS(給藥時(shí)間30秒)，停止霧化后RL的檢測與記錄啟動，霧化PBS后的3分鐘所記錄的RL的均值即為激發(fā)前的基礎(chǔ)值，隨后逐次吸入遞增濃度(4，8，16，32，64，128和256mg/mL)的氯化乙酰膽堿(Acetylcholine chloride，ACh)溶液，每次加樣體積、霧化時(shí)間和記錄持續(xù)時(shí)長需與基線檢測保持相同。記錄RL，并計(jì)算其較基線 (霧化PBS后測得的均值) 增加的百分比(%)。使RL比基線升高100%所需的ACh濃度記為PC100，為了方便數(shù)據(jù)分析，將RL曲線的橫坐標(biāo)變轉(zhuǎn)換為對數(shù)形式。將-log PC100作為反映氣道反應(yīng)性的指征。

4、 肺泡灌洗液中的細(xì)胞因子檢測

氣道阻力檢測結(jié)束后，并以1.5% 戊巴比妥(200mg/kg)腹腔注射麻醉處死小鼠，將0.6mL冰PBS經(jīng)氣管插管緩慢注入肺部進(jìn)行全肺灌洗，抽吸2～3次，每只小鼠灌洗3次，收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。將回收的 BALF在3000rpm、4℃條件下，離心10min，吸取上清液，用作細(xì)胞因子蛋白檢測。根據(jù)說明書進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，檢測IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、TNF-α的表達(dá)水平。

5 肺組織學(xué)檢測及免疫組織化學(xué)染色

小鼠肺組織用4%多聚甲醛(20cmH2O的壓力注入)固定后，經(jīng)脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體處理，分別觀察氣道炎性細(xì)胞浸潤和平滑肌增生的情況。在20倍或40倍光鏡下，根據(jù)支氣管或小血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行炎癥評分[6]：0分，支氣管或小血管周圍幾乎沒有炎癥細(xì)胞浸潤；1分：支氣管或小血管周圍偶有少量炎癥細(xì)胞浸潤；2分：支氣管或血管周圍被炎癥細(xì)胞包繞，細(xì)胞層較薄(≤5層)；3分：支氣管或血管周圍被厚層細(xì)胞(>5層)圍繞。每只小鼠計(jì)數(shù)至少10個(gè)視野，將其炎癥評分的均數(shù)作為觀察值進(jìn)行比較、分析。并對每只小鼠選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)具有完整橫切面的支氣管旁嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，計(jì)數(shù)寬度(測量時(shí)與支氣管垂直)控制在100μm左右。計(jì)算每只小鼠的支氣管旁不同炎癥細(xì)胞的密度(個(gè)/100μm)的均值并統(tǒng)計(jì)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad PRISM 5.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Kruskal-Wallis 單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)進(jìn)行多組間的比較，差異有顯著性時(shí)進(jìn)一步用S-N-K法進(jìn)行兩兩比較。采用Spearman分析不同變量之間的相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 兩種內(nèi)型的哮喘小鼠均出現(xiàn)小氣道功能障礙

三組小鼠之間FVC值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A)。兩種內(nèi)型的哮喘模型中均存在小氣道功能障礙。與對照組相比，非T2型哮喘小鼠模型的MMEF、FEF50和FEF75均下降 (圖1 B-D)，T2型哮喘小鼠中MMEF、FEF50也降低(圖1 B-C)。兩種哮喘模型相比較，OVA+ozone組小鼠較OVA組表現(xiàn)出小氣道功能更差的趨勢，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 兩種內(nèi)型的哮喘小鼠的小氣道功能(n=18，每組6只)。

采用EMMS FM系統(tǒng)檢測小鼠小氣道功能。(A) FVC。(B-D)小鼠小氣道功能 (MMEF、FEF50、FEF75)。*P<0.05，**P<0.01。

二、 兩種內(nèi)型的哮喘模型均表現(xiàn)出相應(yīng)的氣道炎癥

與對照組相比，兩種哮喘模型小鼠的氣道中均出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，并伴有支氣管壁增厚(圖2A)，炎癥評分也顯示兩組小鼠的氣道炎癥較對照組均加重(圖2B)。OVA組較OVA+ozone組表現(xiàn)出更多的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(圖2D)，而OVA+ozone組則表現(xiàn)出更多的中性粒細(xì)胞浸潤(圖2C)。

OVA組和OVA+ozone組Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平均高于對照組(圖2E-G)，其中OVA組的IL-13表達(dá)水平較OVA+ozone組更高。IL-17A在兩種哮喘模型中也都表現(xiàn)為顯著升高，其中OVA+ozone組IL-17A水平顯著高于OVA組(圖2H)。

圖2 小鼠的氣道炎癥的病理改變(HE染色，n=18，每組6只)及細(xì)胞因子水平變化(ELISA法，n=18，每組6只)

三、 兩種內(nèi)型的哮喘模型均表現(xiàn)出氣道高反應(yīng)性

三組小鼠經(jīng)PBS霧化后的基線肺阻力(RL)值組間未表現(xiàn)出明顯差異。兩種哮喘模型中，RL濃度反應(yīng)曲線都呈現(xiàn)左移的趨勢，表明與對照組小鼠相比，兩種哮喘模型的氣道反應(yīng)性均增加(圖3A)。與對照組相比，T2型哮喘模型小鼠在64和256 mg/mL ACh濃度刺激下的RL值升高；OVA+ozone誘導(dǎo)的非T2型哮喘模型在8、、32 、64 和256mg/mL ACh濃度下均表現(xiàn)出較對照組顯著增加的氣道阻力。更直觀地，將OVA組和OVA+ozone組的-log PC100與對照組相比，我們發(fā)現(xiàn)兩種哮喘小鼠模型均存在氣道高反應(yīng)性，并且OVA+ozone組似乎表現(xiàn)出更強(qiáng)的氣道反應(yīng)性，但其與OVA組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異 (圖3B)。

圖3 小鼠的氣道反應(yīng)性(n=18, 每組6只)。

(A)HE染色切片的代表性顯微照片(放大倍率為400倍，圖中紅色箭頭指向典型嗜酸性粒細(xì)胞，藍(lán)色箭頭指向典型中性粒細(xì)胞)。(B)氣道炎癥評分。(C)中性粒細(xì)胞密度(每100微米)。(D)嗜酸性粒細(xì)胞密度(每100微米)。(E-H)小鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13及IL-17A的水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

采用EMMS R&C系統(tǒng)檢測小鼠氣道阻力。(A) 氣道阻力(RL)隨ACh濃度增加的平均百分比(橫坐標(biāo)為ACh濃度取對數(shù)值)。(B) -logPC100 (使RL較基線增加100%所需的乙酰膽堿濃度)。圖A中*代表與對照組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

四、兩種內(nèi)型的哮喘模型均表現(xiàn)出氣道重塑

OVA組和OVA+ozone組的小鼠較對照組均出現(xiàn)明顯的氣道平滑肌增生(圖4A)。OVA+ozone小鼠中的氣道平滑肌增生比OVA組更明顯(圖4B)。

圖4 小鼠氣道平滑肌改變(免疫組織化學(xué)法，n=18，每組6只)

五、兩種哮喘模型中小氣道功能與氣道炎癥、氣道反應(yīng)性及氣道重塑相關(guān)小氣道功能指標(biāo)中，MMEF、FEF50在哮喘模型組較對照組表現(xiàn)出較大差異(圖1B-C)，所以此處以MMEF、FEF50作為代表，分析了其與反映氣道炎癥的BALF細(xì)胞因子水平、代表氣道阻力的-logPC100及反映氣道重塑的α-SMA陽性面積百分比的相關(guān)性。結(jié)果顯示MMEF及FEF50與氣道阻力、氣道平滑肌增生呈現(xiàn)出良好的負(fù)相關(guān)性(圖5A-B、G-H)。BALF中的炎性細(xì)胞因子也與小氣道功能呈現(xiàn)出相關(guān)性(圖5C-F、I-L)，其中IL-17A與MMEF(r=-0.6677，P=0.0025)和FEF50(r=-0.6677，P=0.0031)均呈現(xiàn)較其他幾種所測細(xì)胞因子更強(qiáng)的相關(guān)性。

圖5 小氣道功能與氣道炎癥、氣道反應(yīng)性、氣道重塑的相關(guān)性(n=18，每組6只)

討 論

本研究中，OVA和OVA+ozone兩種小鼠模型均表現(xiàn)出T2和非T2型哮喘的相應(yīng)特征，均存在氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性以及氣道重塑，但OVA組小鼠表現(xiàn)出更高的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥及Th2型細(xì)胞因子，模擬了T2型哮喘內(nèi)型；OVA +ozone組則表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤以及Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平升高，與我們之前的研究結(jié)果相似[6]，模擬了非T2型哮喘內(nèi)型。小氣道功能的異常在哮喘患者的臨床研究中起著重要作用[3,7]，但在臨床患者中難于模擬或收集足夠的T2型和非T2型哮喘病例進(jìn)行研究，本研究在小鼠中建立上述兩種內(nèi)型的哮喘模型，將哮喘中小氣道功能的研究擴(kuò)展到動物模型中。

已有部分研究從病理學(xué)角度對從小鼠小氣道的病理進(jìn)行了不同的探討和定義，包括根據(jù)支氣管肺泡管連接處的距離、氣道直徑<100μm或<400μm等方式[8-10]，但對于小鼠小氣道的定義尚未達(dá)成共識。從肺功能的角度評估小鼠小氣道功能的研究仍缺乏，本研究采用模擬人類肺功能測定的EMMS eDacq FM系統(tǒng)檢測小鼠氣道功能，探索了兩種哮喘內(nèi)型中小氣道功能是否存在異常及其可能的機(jī)制。

氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的典型特征，在哮喘的病理生理機(jī)制中起重要作用[11]。所以我們根據(jù)不同的代表性指標(biāo)，分析了小氣道與以上三者的相關(guān)性。我們的研究表明，小氣道功能指標(biāo)如FEF50、MMEF與BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IL-17A水平提示的氣道炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在哮喘中小氣道存在與大氣道相似甚至更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，伴有IL-4、IL-5 mRNA的表達(dá)增加[12-14]。本研究的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了小氣道功能異常與氣道炎癥程度的相關(guān)性，對于小氣道的干預(yù)在哮喘氣道炎癥的治療中不可忽視。小氣道功能障礙與氣道高反應(yīng)性的相關(guān)性在臨床研究中已有較多發(fā)現(xiàn)[15-17]，本課題組的前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)小氣道功能障礙可能參與了慢性咳嗽患者氣道高反應(yīng)性的發(fā)生[18]。本研究進(jìn)一步在小鼠模型中驗(yàn)證了哮喘環(huán)境下氣道高反應(yīng)性與小氣道功能障礙密切相關(guān)，針對具有小氣道功能障礙的患者，能到達(dá)更遠(yuǎn)端氣道的氣霧劑可能對其治療具有更大的幫助。慢性氣道重塑是哮喘的基礎(chǔ)表征之一[19]，氣道平滑肌增厚是氣道重塑的一種主要表現(xiàn)，α-SMA由平滑肌細(xì)胞表達(dá)并作為平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物[20]。 哮喘中的氣道重塑除了涉及大氣道外，也涉及小氣道[21-22]，但關(guān)于哮喘中小氣道功能障礙與氣道重塑的關(guān)系研究仍較少。本研究中兩種哮喘小鼠模型中均出現(xiàn)氣道重塑，并與小氣道功能障礙表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。說明在哮喘環(huán)境下，氣道重塑也發(fā)生在(A) MMEF與氣道反應(yīng)性的相關(guān)性。(B) MMEF與氣道重塑的相關(guān)性。(C-F) MMEF與BALF中炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性。(G) FEF50與氣道反應(yīng)性的相關(guān)性。(H) FEF50與氣道重塑的相關(guān)性。(I-L) FEF50與BALF中炎性因子的相關(guān)性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。ns，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

小氣道，并可能與小氣道功能障礙共同促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展。有研究表明中性粒細(xì)胞可能參與促進(jìn)氣道重塑[23]，這可能有助于解釋本研究中非T2型哮喘模型比T2型哮喘模型更嚴(yán)重的氣道重塑的結(jié)果。

此外，盡管T2型和非T2型哮喘模型小氣道功能的結(jié)果相近，但小氣道功能障礙可能存在不同的機(jī)制。OVA組中Th2相關(guān)細(xì)胞因子如IL-13水平更高，而OVA+ozone則誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的IL-17A以及更嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞浸潤。OVA+ozone組更嚴(yán)重的氣道平滑肌增生，也可能影響這一內(nèi)型哮喘的小氣道功能。因此，這兩類哮喘的治療可能需要更個(gè)體化的方案，有必要對它們參與小氣道功能異常的潛在信號通路進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，小氣道功能障礙存在于不同內(nèi)型的哮喘中，其發(fā)病機(jī)制與氣道炎癥的嚴(yán)重程度、氣道反應(yīng)性以及氣道重塑的情況密切相關(guān)，并且在T2型和非T2型哮喘模型中，小氣道功能障礙的機(jī)制可能不同，仍需進(jìn)一步研究探索是否干預(yù)相應(yīng)細(xì)胞因子可以恢復(fù)小氣道功能。