殷曉偉 楊玉柱 賈賀 徐雪房 黃政 許艷梅

胸水脫落細(xì)胞學(xué)鑒別惡性間皮瘤(Malignant mesothelioma， MM)與反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生(Reactive mesothelial hyperplasia， RMH)的難點(diǎn)在于形態(tài)上瘤細(xì)胞存在重疊，而侵犯鄰近組織等組織學(xué)特點(diǎn)在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中無法觀察，此時(shí)增加細(xì)胞塊切片輔助免疫細(xì)胞化學(xué)染色可有效提高M(jìn)M的診斷準(zhǔn)確率，所以尋找一組可靠的免疫標(biāo)記物尤為重要。隨著細(xì)胞DNA-ICM技術(shù)被廣泛應(yīng)用，使腫瘤的研究提高到了定量分析水平[1]，近年來，因其特異性強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，在宮頸癌及乳腺癌的臨床診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值[2-4]。已有學(xué)者提出DNA-ICM技術(shù)在惡性胸水的診斷中有較高的靈敏度[5]，可能為良惡性漿膜腔積液的鑒別提供一種新的診斷思路。本文分別探討免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及細(xì)胞DNA-ICM技術(shù)的診斷價(jià)值，進(jìn)一步分析聯(lián)合應(yīng)用對(duì)漿膜腔積液內(nèi)MM的診斷價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集山東省單縣中心醫(yī)院2014年1月—2019年12月間經(jīng)組織學(xué)證實(shí)的胸水病例共50例，其中MM 30例，男性12例，女性18例，年齡39～74例(中位年齡62歲)；RMH 20例，男性13例，女性7例，年齡45～77歲(中位年齡65歲)。所有病例均有組織病理證實(shí)診斷準(zhǔn)確。

二、研究方法

將新鮮胸水制備細(xì)胞涂片兩張，一張室溫下瑞氏-吉姆薩染色在光學(xué)顯微鏡下分析，一張行改良Feulgen DNA染色，用于DNA定量掃描分析，其余標(biāo)本離心后經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)處理后，石蠟包埋制成做細(xì)胞塊用于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

三、判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫細(xì)胞化學(xué)聯(lián)合檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)：EZH2、GLUT-1任意一項(xiàng)檢測(cè)陽性即為陽性。

DNA倍體分析結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：系統(tǒng)將掃描細(xì)胞自動(dòng)分類并計(jì)數(shù)，同時(shí)通過測(cè)定細(xì)胞核的積分光密度來判斷DNA的相對(duì)含量，DNA含量的大小描述為 DNA 指數(shù)( DNA index，DI)，正常細(xì)胞DI值為1，當(dāng)DI>2. 5為異倍體細(xì)胞，且異常細(xì)胞數(shù)≥3個(gè)為陽性，DI≤2.5者為陰性[6]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、百分比表示，比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)EZH2、GLUT-1在胸腔積液中的表達(dá)情況

EZH2陽性定位于細(xì)胞核，在30例MM中(見圖1A)陽性表達(dá)率為83%，20例RMH中(見圖1B)陽性表達(dá)率為25%，EZH2在MM與RMH中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GLUT-1陽性定位于細(xì)胞膜，在30例MM中(見圖2A)陽性表達(dá)率為70%，20例RMH中(見圖2B)無陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

圖1 EZH2的表達(dá)情況 SP×200

圖2 GLUT-1的表達(dá)情況 SP×200

表1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)EZH2、GLUT-1在胸腔積液中的表達(dá)情況

二、EZH2和GLUT-1聯(lián)合檢測(cè)在胸水MM中的診斷價(jià)值

EZH2、GLUT-1對(duì)MM診斷的靈敏度分別為80%、70%，特異度分別為73%、72%，當(dāng)EZH2、GLUT-1聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，對(duì)MM診斷的靈敏度為93%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，特異度為86%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

表2 聯(lián)合檢測(cè) EZH2、GLUT-1對(duì)胸腔積液內(nèi)MM診斷的靈敏度和特異度

三、DNA定量分析結(jié)果

50例樣本，經(jīng)活檢組織證實(shí)其中MM 30例，DNA掃描診斷27例，RMH 20例，經(jīng)DNA掃描診斷16例，DNA倍體分析符合率和陽性檢出率分別為86%(43/50)、90%(27/30)(見圖3，4)。

圖3 一例惡性間皮瘤胸水標(biāo)本DNA定量分析檢測(cè)

四、各種檢查方法靈敏度及特異度的比較

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)EZH2及GLUT-1在MM診斷的靈敏度、特異度分別為93%，86%，DNA定量分析的靈敏度及特異度分別為90%、80%，聯(lián)合應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及DNA定量分析敏感度為97%，特異度為75%(見表3)。

表3 各種檢查方法靈敏度及特異度[n(%)]

討 論

漿膜腔積液是MM常見的首發(fā)癥狀，并且樣本的獲取相對(duì)安全，操作簡單易行，因此細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)于MM的診斷具有無法取代的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)病變的間皮性質(zhì)明確時(shí)，MM與RMH的鑒別是病理醫(yī)師需要面臨的重大挑戰(zhàn)，雖然RMH是良性病變，但有時(shí)與MM的細(xì)胞學(xué)特征重疊，僅涂片和常規(guī)染色難以鑒別診斷[7-8]，因此尋找一種有效的生物標(biāo)記物尤為重要。本課題前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EZH2及GLUT-1抗體組合在組織病理中是區(qū)分MM與RMH的有效生物標(biāo)志物[9]，故推測(cè)在漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)診斷中亦具有一定的價(jià)值。

圖4 一例反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生性胸水標(biāo)本DNA定量分析檢測(cè)

Zeste 基因增強(qiáng)子人類同源物2(Enhancer of zeste homolog ，EZH2)是人PcG基因家族中多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)的核心組成成份，是近年在表觀遺傳領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)的一種具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的腫瘤相關(guān)蛋白，具有靶向催化組蛋白H3第27位賴氨酸(H3K27)甲基化的作用，參與細(xì)胞的周期調(diào)控、衰老和細(xì)胞分化并可沉默細(xì)胞分化相關(guān)基因參與腫瘤的發(fā)生[10-13]。早期研究表明，EZH2在MM組織中的表達(dá)明顯高于RMH，而EZH2的敲除，則抑制MM發(fā)生，Jiang等[14]研究漿膜腔積液中EZH2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示惡性積液中陽性表達(dá)率為90%，而RMH為16%。 在我們的研究中 EZH2在30例MM中陽性表達(dá)率為83%，20例RMH中陽性表達(dá)率為25%，結(jié)果與Jiang等人的研究相符。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glucose transporter protein 1，GLUT-1)是目前已知分布最為廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)等功能起到關(guān)鍵作用[15]，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，已有報(bào)道在多種上皮源性惡性腫瘤中均有 GLUT-1的過表達(dá)[16-17]。漿膜腔積液中的腫瘤細(xì)胞因無法依靠血管生成獲取氧及營養(yǎng)物質(zhì)，此時(shí)腫瘤細(xì)胞在低氧狀態(tài)下主要通過糖酵解獲能，葡萄糖的攝取及代謝均處于增高狀態(tài)，細(xì)胞對(duì)其所處微環(huán)境的反應(yīng)導(dǎo)致GLUT-1過表達(dá)。有研究[18]提出GLUT-1在胸水良惡性病變的鑒別上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。以往研究的關(guān)注點(diǎn)大部分集中在轉(zhuǎn)移性腺癌與RMH的鑒別，而針對(duì)MM與RMH的研究較少，本研究在病變明確為間皮來源的基礎(chǔ)上，利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)30例MM中GLUT-1陽性表達(dá)率為70%，而在20例RMH中均未見表達(dá)，由此可見，GLUT-1是一種在漿膜腔積液內(nèi)鑒別良惡性間皮病變的重要腫瘤標(biāo)志物。在最近的兩項(xiàng)間皮病變研究中，EZH2對(duì)MM診斷的敏感度為45%～66%，聯(lián)合BAP1和EZH2可將敏感度增加到74%～90%[8]。本實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合EZH2和GLUT-1的敏感性為93%，大大提高了MM診斷的可靠性。

DNA是細(xì)胞生長、繁殖的基礎(chǔ)，正常人體細(xì)胞為二倍體，生理狀態(tài)下DNA結(jié)構(gòu)及含量發(fā)生周期性變化[1]。當(dāng)細(xì)胞惡變時(shí)，基因突變可導(dǎo)致染色體數(shù)目發(fā)生改變，從而形成非整倍體細(xì)胞。DNA含量的改變能較客觀地反應(yīng)細(xì)胞的增生狀態(tài)，因此，若出現(xiàn) DNA 含量異常增高或是處于增殖期的細(xì)胞數(shù)目異常增多，均可提示機(jī)體組織有惡性病變的可能[19]。目前，就DNA-ICM的臨床應(yīng)用已經(jīng)達(dá)成了國際共識(shí)。也有越來越多的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)了DNA-ICM作為一種輔助方法適用于宮頸上皮內(nèi)病變和浸潤癌的診斷和預(yù)后。同時(shí)有研究提出，DNA-ICM在判斷漿膜腔積液的良惡性質(zhì)方面，具有一定臨床價(jià)值[20-22]。本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)活檢組織證實(shí)的 30例MM及20例RMH的漿膜腔積液內(nèi)檢測(cè)了細(xì)胞的DNA含量，經(jīng)DNA掃描診斷符合率和陽性檢出率分別為86%(43/50)、90%(27/30)，均提示其在漿膜腔積液內(nèi)良惡性間皮病變的鑒別中，有較高的使用價(jià)值。

雖然細(xì)胞塊聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在漿膜腔積液的診斷中有肯定的臨床價(jià)值，但由于敏感性不高而出現(xiàn)一部分假陰性。而細(xì)胞 DNA 定量分析法可快速識(shí)別標(biāo)本中少數(shù)癌變細(xì)胞，其診斷結(jié)果較常規(guī)方法更客觀。本研究運(yùn)用脫落細(xì)胞學(xué)DNA定量分析檢測(cè)MM的靈敏度為90%，與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但若兩者聯(lián)合使用則有較好的互補(bǔ)性，其敏感度達(dá)97%?？娠@著提高漿膜腔積液內(nèi)良惡性間皮病變鑒別診斷的準(zhǔn)確性，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。