林俊泓，趙 瑤，陳玉娟，王 讓，馬鮮平，2*，易華山，2* (.西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院 免疫學(xué)研究中心，重慶 榮昌 402460)

藍(lán)舌病(bluetongue，BT)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)、環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的藍(lán)舌病毒(bluetongue virus，BTV)感染反芻動物引起的非接觸性傳染病，通過庫蠓叮咬傳播，患病動物出現(xiàn)口鼻黏膜充血潰瘍、唇部水腫、舌部發(fā)紺等癥狀，對綿羊的致死率較高[1-2]。1979年，張念祖等[3]首次在我國云南省發(fā)現(xiàn)并分離BTV。近年來，由于BT流行造成的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，OIE)將BT列為法定通報(bào)動物疫病，我國也將其列為一類動物疫病[4]。目前已有血清型BTV-1～27及若干候選新血清型(BTV-28、BTV-29、BTV-30、BTV-33、BTV-35)，各型間交叉免疫的缺乏使動物較難獲得有效疫苗保護(hù)[5-7]。除BTV-8等少數(shù)血清型外，山羊、牛等感染BTV后一般無明顯臨床癥狀，又成為BTV重要傳染源[8]。

BTV是雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)病毒，成熟病毒粒子為二十面體對稱的無囊膜圓形顆粒，由10個(gè)節(jié)段dsRNAs組成的基因組編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和至少4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)，其中NS1促進(jìn)病毒蛋白質(zhì)合成、NS2形成包涵體、NS3/NS3A調(diào)控BTV釋放[9-11]。細(xì)胞對入侵的病毒通過模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)如維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)與黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5(melanoma differentiation associated protein 5，MDA5)等識別并激活TANK結(jié)合激酶1(tank-binding kinase 1，TBK1)等,從而產(chǎn)生具有啟動與增強(qiáng)抗原遞呈、抑制病毒復(fù)制等廣泛生物學(xué)活性的干擾素(inteferon，IFN)[12]。IFN激活Janus酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子(janus tyrosine kinases-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)通路與后續(xù)胞核內(nèi)的IFN刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)如ISG15、泛素特異性蛋白酶18(ubiquitin-specific protease 18，USP18)等，發(fā)揮相應(yīng)的抗病毒功能[13]。2011年，RATINIER等[14]在BTV Seg-9編碼VP6的開放閱讀框(open reading frame，ORF)中發(fā)現(xiàn)編碼BTV NS4的ORF。NS4含77～79個(gè)氨基酸殘基，在BTV-2、BTV-4、BTV-8等血清型中均高度保守[14-15]。RATINIER等[15]進(jìn)一步構(gòu)建BTV NS4缺失突變的研究表明NS4能拮抗IFN的產(chǎn)生，但不影響mRNA剪切或翻譯，表明NS4可能作用于轉(zhuǎn)錄而非翻譯水平。此外，NS4還與NS3共同作用通過靶向JAK-STAT通路中STAT1的SH2結(jié)構(gòu)域并抑制其磷酸化、二聚化及核內(nèi)轉(zhuǎn)位[16]。鑒于上述NS4拮抗宿主天然免疫的研究，本研究構(gòu)建表達(dá)BTV NS4基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，分析NS4-EGFP蛋白亞細(xì)胞定位特征及其對仙臺病毒(Sendai virus，SeV)誘導(dǎo)的IFN通路基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，為后續(xù)進(jìn)一步研究NS4蛋白在BTV侵染宿主細(xì)胞過程拮抗IFN免疫應(yīng)答的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒BTV NS4基因pMD-T-Simple-NS4質(zhì)粒、pcDNA3.1-eGFP質(zhì)粒和SeV由西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)科學(xué)研究中心保存；HEK-293T細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉太行博士惠贈。

1.2 主要試劑DNA Marker、NheⅠ、BamHⅠ、T4DNA連接酶均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、Axygen quick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；GFP Mouse Monoclonal Antibody、Flag Tag Mouse Monoclonal Antibody、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG HRP(H+L)、胰酶、細(xì)胞裂解液、DAB顯色試劑盒、0.1%TritonX-100、DAPI等購自碧云天生物技術(shù)公司；DMEM培養(yǎng)基(低糖)、胎牛血清、雙抗(青鏈霉素)、PBS、EDTA購自Gibco公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司；TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒購自全式金公司；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。倒置熒光顯微鏡LEICA DMi8購自德國LEICA公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成參照NCBI中GenBank收錄NS4基因序列(AFV68249.1)設(shè)計(jì)并合成引物NS4 F和NS4 R，在上下游引物5′端分別加入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)(雙下劃線部分)，在上游引物酶切位點(diǎn)后添加Kozak序列(虛線部分)，在下游引物酶切位點(diǎn)后添加3×FLAG標(biāo)簽(下劃線部分)。引物NS4 F：5′-CTAGCTAGCACCATGGATGGTGAGGGGACACAACAGA-3′;NS4 R：5′-GCCCTAGGCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC-GATCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTCC-CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTACCC-ATCCTCCTCTGCTCG-3′。擴(kuò)增NS4完整的ORF區(qū)，目的基因片段大小為321 bp。參照NCBI中GADPH(XM_027961471.1)、RIG-Ⅰ(XR_00-4673265.1)、MDA5(NM_022168.4)、VISA(NM_001206491.2)、TBK1(KU_182750.1)、IKKε(DQ_667176.1)、IRF3(XM_008966963.2)、TRAF3(NM_001199427.2)、TRAF6(XM_035012591.1)、IRF9(NM_001385400.1)、ISG15(NG_033033.2)、USP18(NM_017414.4)、IFN-α(NM_024013.3)、IFN-β(NM_002176.4)序列應(yīng)用Primer-BLAST程序設(shè)計(jì)合成qRT-PCR引物(表1)，引物由北京華大生物有限公司合成。

表1 引物序列及用途

1.4 NS4基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建以pMD-T-Simple-NS4為模板，NS4-F、NS4-R為引物PCR擴(kuò)增NS4基因，反應(yīng)總體系為25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。按照凝膠回收試劑盒說明書，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。回收產(chǎn)物經(jīng)NheⅠ、BamHⅠ雙酶切，并與同樣酶切后凝膠回收的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-eGFP連接、轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定及DNA測序、NCBI BLAST比對后，命名為pcDNA3.1-NS4-eGFP。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞在BSL2實(shí)驗(yàn)室用添加10% 胎牛血清和雙抗(100 mg/L青霉素、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，37℃，50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，試驗(yàn)操作均采用對數(shù)期生長細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞鋪于24孔板，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，按照LipofectamineTM2000說明書將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS4-eGFP和真核表達(dá)載體pcDNA3.1-eGFP轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，37℃，50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 Western blot分析及共聚焦顯微鏡觀察將生長良好的HEK-293T細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NS4-eGFP和pcDNA3.1-eGFP，轉(zhuǎn)染24 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染后24 h收集HEK-293T細(xì)胞，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%封閉液37℃封閉1.5 h；鼠抗GFP抗體和鼠源FLAG抗體(一抗)1∶1 000稀釋，室溫孵育2 h；PBST洗膜6次，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(二抗)以1∶5 000比例稀釋，室溫孵育1 h；PBST洗6次，顯影，使用超高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測儀FUSION FX-XT分析重組蛋白的表達(dá)情況。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置入經(jīng)75%酒精處理的爬片，鋪生長良好的HEK-293T細(xì)胞，按前述操作轉(zhuǎn)染24 h后，參考文獻(xiàn)[17]的方法去培養(yǎng)基，用1×PBS洗3次，再用預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定20 min，隨后進(jìn)行室溫DAPI染色10 min，1×PBS潤洗2次后，應(yīng)用共聚焦熒光顯微鏡觀察攝像分析。

1.7 qRT-PCR分析SeV誘導(dǎo)的IFN相關(guān)基因mRNA表達(dá)將生長良好的HEK-293T細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，分別將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS4-eGFP及pcDNA3.1-eGFP轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。接種20 HAU/mL SeV分別刺激24，48 h，收集細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后1×PBS清洗3次，提取細(xì)胞總mRNA，反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板，以GADPH、RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、ISG15、USP18、IFN-α、IFN-β基因引物參照全式金生物TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒操作說明進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL。應(yīng)用ABI QuantStudio 3 Quantitative RT-PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃變性30 s，94℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 NS4基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS4-eGFP如圖1A所示，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測及PCR擴(kuò)增鑒定，在321 bp附近可見目的基因片段(圖1B)。重組質(zhì)粒菌液經(jīng)重慶華大基因有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行在線BLAST和BioEdit軟件分析比對，堿基均未發(fā)生突變，結(jié)果表明pcDNA3.1-NS4-eGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.重組質(zhì)粒示意圖；B.重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增鑒定。M1.DL5000 DNA Marker；1.重組質(zhì)粒電泳產(chǎn)物；2.NS4基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M2.DL2000 DNA Marker

2.2 NS4基因真核表達(dá)及亞細(xì)胞定位將pcDNA3.1-NS4-eGFP以及pcDNA3.1-eGFP轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，于36 h通過倒置熒光顯微鏡觀察后裂解收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析蛋白表達(dá)；將pcDNA3.1-NS4-eGFP以及pcDNA3.1-eGFP轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，36 h后通過熒光共聚焦顯微鏡觀察NS4的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NS4-eGFP、pcDNA3.1-eGFP質(zhì)粒細(xì)胞中均呈強(qiáng)的綠色熒光蛋白信號(圖2A)；Western blot 結(jié)果表明，pcDNA3.1-eGFP空載體GFP蛋白約28 kDa，NS4-EGFP融合蛋白約40 kDa(圖2B)；共聚焦顯微鏡觀察，NS4-EGFP融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)主要沿細(xì)胞核膜分布，細(xì)胞核內(nèi)主要集中于核仁部位(圖2C)。結(jié)果表明構(gòu)建的pcDNA3.1-NS4-eGFP真核表達(dá)載體可在HEK-293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)BTV NS4-EGFP融合蛋白，NS4-EGFP融合蛋白在細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有分布。

A.NS4基因瞬時(shí)表達(dá)與倒置熒光顯微鏡觀察;B.NS4基因瞬時(shí)表達(dá)與Western blot分析(1,2.pcDNA3.1-NS4-eGFP表達(dá)產(chǎn)物;3,4.pcDNA3.1-eGFP表達(dá)產(chǎn)物);C.NS4基因瞬時(shí)表達(dá)與共聚焦顯微鏡觀察(1.NS4-EGFP融合蛋白;2.DAPI染色;3.疊加圖；標(biāo)尺示10 μm)

2.3 NS4基因瞬時(shí)表達(dá)對SeV誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ、MDA5基因mRNA表達(dá)的影響將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS4-eGFP及pcDNA3.1-eGFP分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞24 h后，接種20 HAU/mL SeV分別刺激24，48 h后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察和RIG-Ⅰ、MDA5基因mRNA表達(dá)分析。結(jié)果表明：重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NS4-eGFP及pcDNA3.1-eGFP轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞后SeV誘導(dǎo)24，48 h，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，在HEK-293T細(xì)胞內(nèi)均觀察到由弱到強(qiáng)的綠色熒光信號(圖3A)。分別以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NS4-eGFP及pcDNA3.1-eGFP空載體24 h后接種SeV刺激24，48 h的HEK-293T細(xì)胞cDNA為模板，以GADPH(內(nèi)參基因)、RIG-Ⅰ、MDA5基因引物進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示：在SeV誘導(dǎo)下，pcDNA3.1-NS4-eGFP組與對照組pcDNA3.1-eGFP相比細(xì)胞中RIG-Ⅰ、MDA5基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平均極顯著下調(diào)，特別在SeV誘導(dǎo)24 h后差異極顯著(圖3B，C)。

2.4 NS4基因表達(dá)對IFN相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響進(jìn)一步以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NS4-eGFP及pcDNA3.1-eGFP空載體24 h后接種SeV刺激24，48 h的HEK-293T細(xì)胞cDNA為模板，以GADPH(內(nèi)參基因)、VISA、TBK1、IKKε、TRAF3、TRAF6、IRF3、IFN-α、IFN-β、IRF9、ISG15、USP18基因引物進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示：pcDNA3.1-NS4-eGFP組與對照組pcDNA3.1-eGFP細(xì)胞相比，VISA、IKKε基因在SeV誘導(dǎo)24 h后mRNA表達(dá)水平下調(diào)，且差異顯著(0.010.05)；TBK1、USP18基因在SeV誘導(dǎo)24 h后mRNA表達(dá)水平下調(diào)，且差異極顯著(P<0.01)，48 h后差異不顯著；TRAF6、IRF9、ISG15基因在SeV誘導(dǎo)24，48 h后mRNA表達(dá)水平下調(diào)，差異極顯著(圖4A，B)。在SeV誘導(dǎo)24與48 h后，IFN-α基因mRNA表達(dá)水平下調(diào)，差異顯著(圖5A)；IFN-β基因mRNA表達(dá)水平下調(diào)，差異極顯著(圖5B)。

A.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T與SeV誘導(dǎo)后細(xì)胞熒光顯微鏡觀察；B.qRT-PCR分析RIG-Ⅰ基因mRNA表達(dá)；C.qRT-PCR分析MDA5基因的mRNA表達(dá)。**.差異極顯著(P<0.01)；*.差異顯著(0.01

A.SeV刺激24 h后相關(guān)基因qRT-PCR分析；B.SeV刺激48 h相關(guān)基因qRT-PCR分析

A.IFN-α基因的mRNA表達(dá)分析；B.IFN-β基因的mRNA表達(dá)分析

3 討論

研究表明，BTV作為無囊膜dsRNA病毒，在復(fù)制過程中產(chǎn)生的至少4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)中，NS3/NS3A拮抗宿主干擾素應(yīng)答從而促進(jìn)BTV復(fù)制[16,18]。NS4基因在BTV不同血清型間的表達(dá)有差異，能與細(xì)胞內(nèi)的脂滴相互作用而保護(hù)病毒dsDNA不被胞內(nèi)DNA酶降解[14,19]。研究也發(fā)現(xiàn)，NS4蛋白在IFN-α/β受體缺陷(IFNAR-/-)的小鼠中表達(dá)量低，在一定劑量IFN處理的細(xì)胞中有利于BTV的復(fù)制，是細(xì)胞內(nèi)IFN信號通路的拮抗劑[14-15]。本課題組在前期的研究中對NS4基因進(jìn)行克隆及序列分析[20]，為進(jìn)一步探究NS4基因?qū)FN-β信號通路基因mRNA表達(dá)的影響，本研究成功構(gòu)建BTV NS4基因真核表達(dá)載體，在HEK-293T細(xì)胞中NS4-EGFP融合蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果與RATINIER等[14]報(bào)道的NS4主要位于核仁中，與核仁標(biāo)記物有較強(qiáng)的共定位特征相一致。本研究在此基礎(chǔ)上觀察NS4-EGFP融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中主要沿細(xì)胞核膜分布，對NS4二級結(jié)構(gòu)分析以及構(gòu)建缺失突變體的研究發(fā)現(xiàn)其N端具有核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，C端有核輸出信號(nuclear export signal，NES)，參與核胞漿穿梭，N端的NLS可能與宿主天然免疫反應(yīng)中核內(nèi)激活的IFN刺激反應(yīng)元件(IFN-stimulated response elements，ISREs)有關(guān)[14,20-21]。

天然免疫系統(tǒng)可以通過PRRs識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecule patterns，PAMPs)，進(jìn)而啟動天然免疫應(yīng)答，其中RIG-Ⅰ、MDA5識別病毒后與VISA作用，激活TBK1、IKKε和NF-κB，磷酸化IRF3和IRF7使其入核，產(chǎn)生IFN，激活JAK-STAT信號通路，形成ISGF3入核，從而激活一系列相關(guān)的ISGs發(fā)揮抗病毒作用[22-23]。SeV作為一種RNA病毒，是細(xì)胞IFN應(yīng)答的有效誘導(dǎo)劑[24]。本試驗(yàn)將構(gòu)建的NS4基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NS4-eGFP轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，在SeV誘導(dǎo)作用下，NS4-EGFP融合蛋白對病毒誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ、MDA5基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平具有明顯的下調(diào)作用，表明NS4-EGFP融合蛋白對SeV誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ、MDA5基因轉(zhuǎn)錄具有重要調(diào)節(jié)作用。本研究進(jìn)一步分析VISA、TBK1、IKKε、TRAF3、TRAF6、IRF3、IFN-α、IFN-β、IRF9、ISG15、USP18基因的mRNA表達(dá)水平，表明NS4基因的表達(dá)顯著影響TBK1、TRAF6、IRF9、ISG15、USP18基因mRNA轉(zhuǎn)錄，這可能與SeV誘導(dǎo)的IFN應(yīng)答上游基因RIG-Ⅰ、MDA5下調(diào)表達(dá)相關(guān)，進(jìn)而下調(diào)SeV誘導(dǎo)的下游IFN-β基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)與RATINIER等[15]對BTV構(gòu)建NS4基因缺失突變的研究結(jié)果相一致，但本研究發(fā)現(xiàn)TBK1、TRAF6、IRF9、ISG15、USP18等基因參與NS4基因拮抗宿主細(xì)胞IFN-β信號通路的調(diào)控，為進(jìn)一步研究NS4基因拮抗宿主細(xì)胞天然免疫應(yīng)答的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

在天然免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的Ⅰ型IFN與相應(yīng)的IFN細(xì)胞表面受體(IFNAR)結(jié)合，激活 JAK-STAT信號通路[25]。IFN-α與IFN-β同屬于Ⅰ型IFN，可通過抑制病毒核酸轉(zhuǎn)錄及阻斷細(xì)胞間信號傳遞等發(fā)揮抗病毒作用[26-27]。本研究結(jié)果表明NS4基因的表達(dá)對IFN-α基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制差異不顯著，但極顯著影響IFN-β基因mRNA的轉(zhuǎn)錄，NS4蛋白在BTV調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞RIG-Ⅰ、MDA5基因表達(dá)，依賴MyD88的途徑從而誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生或阻斷JAK-STAT通路來逃避宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答中所發(fā)揮的作用仍需進(jìn)一步研究[28-30]。本研究也發(fā)現(xiàn)在HEK-293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)NS4基因24 h 后，添加SeV誘導(dǎo)48 h，TRAF6、IRF9、ISG15 mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)，但VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3及USP18基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯，表明NS4基因拮抗病毒誘導(dǎo)的IFN信號通路時(shí)可能存在選擇性，且細(xì)胞內(nèi)存在相關(guān)基因的調(diào)節(jié)蛋白時(shí)，可能通過其他分子調(diào)控IFN-β基因表達(dá)。研究表明，豬流行性腹瀉病毒的NSP7、羊口瘡病毒的VIR、口蹄疫病毒的NSP2b以及同為呼腸孤病毒科的輪狀病毒的NSP1等非結(jié)構(gòu)蛋白均具有拮抗宿主IFN應(yīng)答的作用[31-34]。本研究結(jié)果表明BTV NS4基因的表達(dá)，影響RIG-Ⅰ、MDA5、TBK1、TRAF6、IRF9、IFN-β與ISGs(ISG15、USP18)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，拮抗HEK-293T細(xì)胞內(nèi)IFN信號通路，為后續(xù)進(jìn)一步分析BTV NS4基因與IFN信號通路相關(guān)蛋白之間的互作及調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。