陳胡羚，辛怡霖，侯佳琪，王虹雅，唐 熙，李青云，張 欣，李引乾* (.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 7200;2.四川省北川羌族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 北川 622750)

氟苯尼考(florfenicol,FFC)是一種動(dòng)物專用的酰胺醇類高效廣譜抗菌藥物，于20世紀(jì)80年代后期成功研制，在治療畜禽細(xì)菌性疾病中發(fā)揮著重要作用[1-4]。但FFC水溶性極低，在動(dòng)物體內(nèi)的吸收不良，生物利用度低，臨床上通常以混飼方式給藥。當(dāng)畜禽發(fā)病時(shí)，通常食欲廢絕，導(dǎo)致給藥困難，造成藥浪費(fèi)，使用藥成本提高，且易對環(huán)境造成污染[5]。藥物納米晶體是指將藥物顆粒自身納米化制備得粒徑在1～1 000 nm范圍內(nèi)的納米藥物[6-8]。將藥物制成納米晶體，除了可以改善難溶性藥物的溶解性[9-10]，增加藥物的生物利用度外[11-13]，還具有提高藥物療效，減少使用劑量，降低不良反應(yīng)等優(yōu)勢[14]，在醫(yī)藥領(lǐng)域納米晶技術(shù)已被廣泛應(yīng)用以提升藥物的理化性能。氟苯尼考納米晶(florfenicol nanocrystal,FFC-NC)相較其原粉有更優(yōu)的溶解度和其他物理性能，本試驗(yàn)旨在對研制的FFC-NC在雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，考察納米晶對藥物生物利用度的影響，以期為FFC-NC的臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑FFC(FB2002051)購自江蘇恒盛藥業(yè)有限公司；FFC標(biāo)準(zhǔn)品(H1715060)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； FFC-NC，本實(shí)驗(yàn)室自制；羧甲基纖維素納(20190712)、肝素鈉(20191022)和乙腈(20200309)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；醋酸銨(20200508)和甲醇(20200102)購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(200607)購自四川西隴科學(xué)有限公司；乙酸乙酯(20200321)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；蛋雞料購自新希望集團(tuán)廣漢國雄飼料有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物600～650日齡健康羅曼粉蛋雞6只，體質(zhì)量為(2.3±0.2) kg。飼喂不含任何抗生素及藥物的國雄蛋雞料。飼養(yǎng)環(huán)境經(jīng)過嚴(yán)格消毒，其通風(fēng)性好，采光好，溫度為20～25℃，相對濕度為55%～65%。給藥前12 h開始至給藥后6 h禁食，自由飲水。

1.3 動(dòng)物分組及給藥方法給藥前每只雞測體質(zhì)量，并做好標(biāo)記，抽取0.5 mL血液，置于含肝素鈉抗凝劑的離心管中，6 000 r/min離心5 min取上層血漿保存。將FFC原粉和FFC-NC分別用0.2%羧甲基纖維素納水溶液溶解，配制成FFC質(zhì)量濃度為10 g/L 混懸液，按20 mg/kg劑量灌胃給藥。

試驗(yàn)分為FFC原粉組和FFC-NC組。為了減少干擾變量的影響，兩組試驗(yàn)使用同一批健康母雞6只。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，采用交叉試驗(yàn)評價(jià)生物利用度。首先以FFC-NC灌胃給藥，采血測定其血藥濃度。試驗(yàn)?zāi)鸽u經(jīng)歷3周洗脫后，再以相同劑量灌胃給藥FFC原粉。

1.4 血漿樣品采集用藥后0.083，0.25，0.50，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，12，24 h分別翅下靜脈采血0.5 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，5 000 r/min離心5 min，取上層血漿，置于-20℃冰箱保存，血漿樣品在2周內(nèi)測完。

1.5 樣品處理將血漿樣品自然解凍后，混勻，取200 μL血漿，加入400 μL乙酸乙酯以提取FFC。將其渦旋振蕩2 min，充分混勻后，8 000 r/min離心2 min，吸取上層乙酸乙酯提取液。按上述步驟，下層液中加入乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并2次提取液。45℃氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL流動(dòng)相，渦旋振蕩3 min后，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品。

1.6 藥動(dòng)學(xué)方法學(xué)的建立

1.6.1高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)條件 色譜柱采用Shim-pack GIST C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為0.05 mol/L醋酸銨溶液∶乙腈=78∶22(V∶V)，流速：1.0 mL/min，柱溫：20℃，紫外檢測波長：224 nm，進(jìn)樣量：20 μL。

1.6.2方法專屬性 取雞空白血漿200 μL，按1.5方法處理后，按HPLC法進(jìn)樣20 μL得雞空白血漿HPLC圖譜。取雞空白血漿200 μL，加入5 mg/L FFC標(biāo)準(zhǔn)液200 μL，按1.5方法處理后，進(jìn)樣20 μL得雞空白血漿中添加FFC HPLC圖譜。將FFC組和FFC-NC組血漿樣品HPLC圖譜與上述兩圖譜進(jìn)行比較分析。

1.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 于空白血漿中加入FFC標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制質(zhì)量濃度為32 mg/L FFC母液，采用梯度稀釋法，將其稀釋為16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.1 mg/L，將上述所得不同質(zhì)量濃度FFC標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品按1.5項(xiàng)處理后，進(jìn)行HPLC檢測分析。重復(fù)測定3次，取平均值。以FFC質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制雞空白血漿中FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。分別按信噪比S/N=3和S/N=10確定檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.6.4回收率試驗(yàn) 于空白血漿中加入FFC標(biāo)準(zhǔn)液，配制成0.1，4.0，16.0 mg/L低、中、高質(zhì)量濃度FFC血漿樣品，按1.5項(xiàng)方式處理后，進(jìn)行HPLC檢測分析。重復(fù)測定3次，計(jì)算該質(zhì)量濃度樣品的分析方法回收率和變異系數(shù)，計(jì)算公式如下：

回收率(%)=A1/A×100%；

1.6.5精密度試驗(yàn) 精密配制0.1，4.0，16.0 mg/L的低、中、高質(zhì)量濃度的FFC血漿樣品，按1.5項(xiàng)方式處理后，進(jìn)行HPLC檢測分析。分別于同日內(nèi)對每個(gè)質(zhì)量濃度樣品測定3次，不同日內(nèi)連續(xù)測定3 d，將測得的色譜峰面積利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品質(zhì)量濃度，將其與加入量比較，計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。

1.6.6重復(fù)性試驗(yàn) 精密配制6份4 mg/L FFC血漿樣品，按1.5項(xiàng)方式處理后，進(jìn)行HPLC檢測分析，計(jì)算變異系數(shù)。

1.7 血藥濃度測定對1.5項(xiàng)處理血樣所得的供試品，以 HPLC法測定。

1.8 數(shù)據(jù)處理采用DAS 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算包括藥時(shí)曲線下面積(AUC)、消除半衰期(t1/2)、平均駐留時(shí)間(MRT)、峰濃度(Cmax)和峰時(shí)(tmax)在內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。最佳房室模型的確定是依據(jù)赤池信息準(zhǔn)則(akaike information criterion,AIC)值最小原則。利用GraphPad Prism 8.0作圖軟件繪制藥時(shí)曲線，利用IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異性分析。此研究采用單因素方差分析法來檢驗(yàn)顯著性，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性該試驗(yàn)采用方法操作便捷，樣品處理簡單。方法專屬性試驗(yàn)結(jié)果見圖1～4。

圖1 雞空白血漿HPLC圖

圖2 雞空白血漿添加FFC HPLC圖

圖3 FFC原粉組血漿樣品HPLC圖

圖4 FFC-NC組血漿樣品HPLC圖

對比圖1，2可知，色譜圖基線平穩(wěn)，血漿峰與FFC峰分離完全，這說明血漿內(nèi)源性雜質(zhì)不會(huì)干擾FFC的測定，F(xiàn)FC的保留時(shí)間在24 min左右，空白血漿在此處無峰出現(xiàn)。圖3為FFC原粉組血漿樣品的HPLC圖，F(xiàn)FC的保留時(shí)間為24.301 min；圖4為FFC-NC組血漿樣品HPLC圖，F(xiàn)FC的保留時(shí)間為24.459 min；進(jìn)一步說明此方法的專屬性好，適合用于雞血漿中FFC檢測。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍以FFC質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制雞空白血漿中FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。

由圖5可得回歸方程：y=21 693x+4 720.6，(R2=0.999 2,n=3)。FFC在質(zhì)量濃度為0.1～32.0 mg/L 具有良好線性關(guān)系。按信噪比S/N=3求得雞血漿中FFC的LOD為0.03 mg/L。按信噪比S/N=10得LOQ為0.1 mg/L。

2.3 回收率利用 HPLC分別對0.1，4.0，16.0 mg/L 低、中、高質(zhì)量濃度FFC血漿樣品進(jìn)行測定，利用雞空白血漿中FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

圖5 雞空白血漿中FFC標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 回收率結(jié)果(n=3)

由表1結(jié)果可知，各組回收率均高于97%，符合測定要求，說明可采用 HPLC測定雞血漿樣品中FFC考質(zhì)量濃度。

2.4 精密度利用 HPLC法分別對0.1，4.0，16.0 mg/L 低、中、高質(zhì)量濃度FFC血漿樣品進(jìn)行日內(nèi)精密度和日間精密度測定，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精密度測定結(jié)果(n=3)

表2結(jié)果表明，低、中、高3個(gè)不同質(zhì)量濃度FFC血漿樣品的日內(nèi)及日間精密度均小于3.54%，符合測定要求，說明此試驗(yàn)建立的HPLC法可用于測定雞血漿樣品中FFC質(zhì)量濃度。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)對6份4 mg/L的FFC血漿樣品進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果顯示其峰面積為(91 976.83±2 890.475)，平均質(zhì)量濃度為(4.022±0.132) mg/L，RSD值為3.28%，表明此試驗(yàn)建立的HPLC法的重復(fù)性好，檢測結(jié)果具有可靠性。

2.6 血藥濃度測定分別給雞灌胃FFC原粉和FFC-NC后，兩組雞的不同時(shí)間點(diǎn)血藥濃度見表3。

表3 FFC 和FFC-NC 組不同時(shí)間點(diǎn)血藥質(zhì)量濃度 mg/L

由表3可知，在給藥后0.25～6.00 h，F(xiàn)FC-NC組血藥質(zhì)量濃度均高于FFC原粉組，且從6只雞的最大血藥質(zhì)量濃度可以看出，F(xiàn)FC-NC組要高于FFC原粉組。

2.7 藥時(shí)曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.7.1藥時(shí)曲線 分別給母雞灌胃FFC原粉和FFC-NC后，兩組藥物在母雞體內(nèi)的血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線如圖6。

圖6 FFC和FFC-NC組藥時(shí)曲線圖

由圖6可以看出，在試驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)，F(xiàn)FC-NC在雞體內(nèi)的血藥質(zhì)量濃度明顯高于FFC原粉組。FFC-NC組在(0.875±0.137) h時(shí)達(dá)到最大值，為(8.249±0.713) mg/L，而FFC原粉組在(1.167±0.258) h時(shí)達(dá)到最大值，為(2.381±0.796) mg/L。

2.7.2藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 采用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件和IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對生物利用度試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。根據(jù)AIC值最小原則，選擇了最佳模型為一室模型(AIC=7.61)，而非二室模型(AIC=16.52)。兩組試驗(yàn)所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見表4。

表4 FFC和FFC-NC組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

根據(jù)表4可得，與FFC原粉組相比，F(xiàn)FC-NC組的達(dá)峰時(shí)間tmax為(0.875±0.137) h，峰時(shí)縮短，藥時(shí)曲線下面積AUC(0-∞)和峰濃度Cmax分別為(23.957±2.338) mg/(L·h)和(8.249±0.713) mg/L，F(xiàn)FC-NC組的相對生物利用度是FFC組的3.6倍。結(jié)果表明，F(xiàn)FC-NC的藥動(dòng)學(xué)特征較FFC均有明顯改善。

3 討論

FFC在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system,BCS)中屬于第Ⅱ類低溶解性、高滲透性藥物。FFC極微溶于水，影響其臨床使用。將難溶性藥物制備成納米晶，能有效提高其溶解性能，極具發(fā)展前景[15]。臨床用藥可以將藥物納米晶體制成口服制劑、注射制劑、吸入制劑、透皮制劑等多種劑型方便給藥[16]。將藥物納米晶體應(yīng)用于口服制劑，藥物的口服藥動(dòng)學(xué)特征將得到改善[17]。將納米晶應(yīng)用于注射劑，能改善藥物的體外溶出率，提高制劑的安全性[18-19]。將納米晶應(yīng)用于透皮制劑，藥物的溶解性能得到改善，則藥物透皮吸收力增強(qiáng)，從而改善藥物的藥動(dòng)學(xué)特征和生物利用度[20]。

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)是反映藥物在體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律性的一些常數(shù)，是評價(jià)獸藥質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。消除半衰期t1/2指血藥濃度下降一半所需時(shí)間，反映了藥物從體內(nèi)的消除速度，F(xiàn)FC-NC組與原粉組的t1/2無顯著性差異，表明將FFC制成納米晶不影響其在體內(nèi)的消除速度。藥時(shí)曲線下面積AUC(0-∞)是血藥濃度曲線對時(shí)間軸所包圍的面積，是評價(jià)藥物吸收程度的重要指標(biāo)，F(xiàn)FC-NC組AUC(0-∞)為(23.957±2.338) mg/(L·h)與原粉組AUC(0-∞)(6.749±1.577) mg/(L·h)相比極顯著提高(P<0.01)，表明FFC-NC在雞體內(nèi)的吸收好。達(dá)峰時(shí)間tmax反映藥物進(jìn)入體內(nèi)的速度，達(dá)峰時(shí)間tmax越短則吸收速度越快，F(xiàn)FC-NC組tmax(0.875±0.137) h與原粉組tmax(1.167±0.258) h相比顯著縮短(P<0.05)，表明FFC-NC在雞體內(nèi)的吸收速度快。藥峰濃度Cmax是給藥后血藥濃度的最高值，是評價(jià)藥物吸收速率和吸收程度的重要指標(biāo)，F(xiàn)FC-NC組Cmax(8.249±0.713) mg/L與原粉組Cmax(2.381±0.796) mg/L相比極顯著提高(P<0.01)，表明將FFC制成納米晶后，其在雞體內(nèi)的吸收好且吸收速度快。生物利用度是指藥物以一定劑型從給藥部位吸收入血的速率和程度，是評價(jià)藥物質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。生物利用度又分為絕對生物利用度和相對生物利用度，絕對生物利用度是內(nèi)服或其他非血管給藥途徑所得的AUC與靜脈注射的AUC的比值，相對生物利用度則是采用內(nèi)服參照標(biāo)準(zhǔn)藥物的AUC作比較[1]。此試驗(yàn)通過口服給藥，比較FFC原粉和FFC-NC在雞體內(nèi)的生物利用度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)FC-NC組的相對生物利用度是FFC原粉組的3.6倍。

SWITALA等[21]研究FFC在火雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，得出在火雞體內(nèi)FFC的口服生物利用度為82%。TIKHOMIROV等[22]報(bào)道FFC在騾鴨體內(nèi)的口服生物利用度為73.86%。此外，F(xiàn)FC在肉雞和犢牛中的口服生物利用度分別為55.3%和88.0%；給豬口服FFC則幾乎完全被吸收[23]。雞靜脈注射FFC的半衰期為5.36 h，50%～65%的藥物以原形從尿液中排出[1]。以上研究報(bào)道FFC在不同動(dòng)物體內(nèi)的生物利用度。本試驗(yàn)選擇在臨床上使用FFC較多的母雞作為靶動(dòng)物，采用交叉試驗(yàn)法進(jìn)行評價(jià)，減少了由于機(jī)體不同帶來的影響。

FFC在獸醫(yī)臨床的使用上受限，主要是其難溶性和生物利用度低的問題。利用納米技術(shù)將難溶性藥物制備成納米晶，增大比表面積，從而增加其溶解度，改善藥動(dòng)學(xué)特征和生物利用度[24-25]。此試驗(yàn)利用 HPLC考察FFC和其納米晶制劑在雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)FC-NC組的藥動(dòng)學(xué)特征改善明顯。說明FFC-NC制劑相較其原粉，具有更優(yōu)的藥動(dòng)學(xué)特征，本試驗(yàn)為FFC-NC的臨床使用提供試驗(yàn)依據(jù)。