徐麗華,蘇 菲,余 斌,李軍星,鄧?yán)麡s,毛慧敏,吳一戈,楊富文,袁秀芳* (.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 300；.江山康農(nóng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 江山 3400 )

養(yǎng)豬業(yè)是浙江省畜牧業(yè)發(fā)展的重中之重，近年來隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，浙江省養(yǎng)豬行業(yè)的規(guī)?；?、集約化和標(biāo)準(zhǔn)化程度也得到了進(jìn)一步提升，但是制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的豬疫病，尤其危害嚴(yán)重的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬偽狂犬病病毒(PRV)這4種豬病毒性傳染病的防控難度不斷加大，給養(yǎng)豬業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前這4種疫病的臨床癥狀呈非典型性且多樣化，病毒間的混合感染、細(xì)菌的繼發(fā)感染、公豬精液帶毒、母豬隱性感染和垂直傳播、疫苗免疫后的免疫抑制干擾和母源抗體被中和等問題，造成豬場免疫豬群抗體水平參差不齊或免疫失敗，出現(xiàn)傳染性疫病多發(fā)的情況[3-5]。

為較全面客觀地了解浙江省不同地區(qū)豬場的主要疫病的病原流行情況和疫苗免疫現(xiàn)狀，本實驗室于2017—2020年采集浙江省不同地區(qū)豬場的豬血清樣品和臨床疑似病料樣品，分別進(jìn)行PRRSV、CSFV、PCV2和PRV的血清學(xué)抗體監(jiān)測和病原學(xué)檢測，分析當(dāng)前規(guī)模化豬場主要疫病種類、流行狀況和豬群免疫狀況的變化動態(tài)，為養(yǎng)豬企業(yè)制定合理的疫苗免疫程序和有針對性地疫病防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源本實驗室通過實地走訪、現(xiàn)場檢剖和收集送檢樣品等方式，2017—2020年采集浙江省不同地區(qū)(杭州、湖州、嘉興、紹興、金華、衢州、寧波和臺州麗水)豬血清樣品和臨床疑似病料樣品(肺臟、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)和腎臟)，分別用于抗體和病原檢測。

1.2 主要試劑病毒核酸提取試劑盒購自濟(jì)凡生物科技(常州)有限公司；一步法RT-PCR試劑盒購自寶生物(大連)有限公司；高成功率PCR 酶KOD FX購自日本TOYOBO公司；dNTPS等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；無水乙醇等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；PRRSV ELISA抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司，產(chǎn)品批號40959-L481、40959-M191等；CSFV ELISA抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司，產(chǎn)品批號43220-K411、43220-M051等；PRV gI抗體ELISA檢測試劑盒購自美國IDEXX公司，產(chǎn)品批號09836-AP757、09836-FP435等；PRV gB抗體ELISA檢測試劑盒購自美國IDEXX公司，產(chǎn)品批號09836-KN364、09836-CP068等；PCV2抗體ELISA檢測試劑盒購自韓國金諾公司，產(chǎn)品批號PCVB18068等。

1.3 豬血清中PRRSV、CSFV、PCV2和PRV抗體檢測從豬的前腔靜脈采集血液2～3 mL，室溫靜置2 h，離心分離出血清，4℃冷藏備用(超過7 d，-20℃ 凍存)。利用商品化的ELISA抗體檢測試劑盒對豬血清中相應(yīng)的病毒進(jìn)行抗體檢測，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 臨床疑似樣品中PRRSV、CSFV、PCV2和PRV病原檢測

1.4.1引物設(shè)計 PRRSV、CSFV、PCV2和PRV病原檢測的引物序列參考文獻(xiàn)[6]方法，委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.2 核酸(DNA/RNA)提取取臨床疑似病料0.1 g，置于Eppendorf管中，加入PBS緩沖液(pH7.4)0.5 mL，用全自動研磨儀(90 Hz,60 s)研磨成勻漿，-70℃凍融3次，高速離心，取上清0.15 mL，用病毒核酸提取試劑盒提取核酸，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3PCR擴(kuò)增及電泳 按照一步法RT-PCR檢測試劑盒說明書操作擴(kuò)增 PRRSV和CSFV病原。25 μL體系，混勻分裝后置PCR 擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增條件：50℃ 30 min;95℃ 2 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 60 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

PCV2和PRV病原PCR擴(kuò)增：25 μL反應(yīng)體系分別：2×PCR Buffer 12.5 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，引物各1.5 μL(濃度為5 μmol/L)，KOD FX(1.0 U/μL)0.5 μL，模板DNA為2.0 μL，ddH2O 2 μL?；靹蚍盅b后置PCR 擴(kuò)增儀中，擴(kuò)增條件：94℃ 2 min；98℃ 10 s，68℃ 1 min，35個循環(huán)；最后68℃延伸7 min。

反應(yīng)完成后，分別取PCR產(chǎn)物5 μL，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集情況2017—2020年共采集浙江省不同地區(qū)豬血清樣品34 000余份，臨床疑似病料樣品2 000余份。各疾病的樣本采集及檢測情況參見表1，2。

表1 2017—2020年浙江地區(qū)用于檢測4種疫病的豬血清樣本數(shù)統(tǒng)計 份

表2 2017—2020年浙江地區(qū)用于檢測4種疫病的臨床疑似樣本數(shù)統(tǒng)計 份

2.2 血清學(xué)檢測結(jié)果對浙江省不同地區(qū)豬場進(jìn)行PRRSV、CSFV、PRV-gE/gI、PRV-gB、PCV2的血清學(xué)抗體水平的檢測。近4年來，PRRSV、CSFV、PCV2、PRV-gE/gI、PRV-gB的抗體平均陽性率分別為81.4%(26 578/32 654),83.6%(26 322/31 471),91.4%(8 382/9 172),36.1%(12 308/34 090),94.3%(17 336/18 392)。

2.2.12017—2020年4種疫病抗體檢測結(jié)果 2017—2019年P(guān)RRSV抗體陽性率為82.0%～85.0%，而2020年抗體陽性率為70.8%，下降明顯。CSFV抗體陽性率從2017年的83.3%上升到2020年的86.3%，呈現(xiàn)穩(wěn)中有升的狀態(tài)。PCV2抗體陽性率2017和2018年均在89.5%左右，2019年和2020年上升到95.0%左右，抗體水平穩(wěn)定上升。PRV-gB抗體陽性率在4年來一直維持在92.0%～95.0%之間。PRV-gE/gI抗體陽性率在2017和2018年均為40.0%，然后逐年下降，到2020年為20.3%(圖1)。

2.2.2浙江省不同地區(qū)抗體檢測結(jié)果 將浙江省分為杭州地區(qū)、金華地區(qū)、湖州地區(qū)、嘉興地區(qū)、寧波地區(qū)、紹興地區(qū)、衢州地區(qū)和溫州麗水臺州地區(qū)，進(jìn)行血清抗體陽性率比較。2017—2019年不同地區(qū)PRRSV抗體陽性率相對穩(wěn)定，保持在75.0%～85.0%之間，2020年抗體水平差異大，其中衢州地區(qū)抗體陽性率下降明顯(51.9%)。CSFV抗體陽性率不同地區(qū)差異較小，均在77.0%～90.0%之間。嘉興地區(qū)PCV2抗體陽性率從2017年的65.0%上升到2020年的95.0%，其他地區(qū)一直穩(wěn)定在90.0%～95.0%之間。不同地區(qū)PRV-gB抗體陽性率一直維持在較高水平，而PRV-gE/gI抗體陽性率隨時間推移均有不同程度的下降，其中杭州、寧波、湖州、衢州地區(qū)下降明顯，在10%以下(圖2)。

圖1 2017—2020年P(guān)RRSV、CSFV、PRV-gE/gI、PRV-gB、PCV2抗體檢測結(jié)果

2.2.3不同日齡豬群抗體檢測結(jié)果 將豬群分為公豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、產(chǎn)房仔豬、保育豬和肥育豬，進(jìn)行4種疫病抗體陽性率的比較。PRRSV抗體陽性率在產(chǎn)房仔豬和保育豬階段呈下降趨勢(60%～70%)，肥育豬抗體水平上升。種豬群CSFV抗體陽性率較高，均在90%以上，產(chǎn)房仔豬抗體陽性率開始下降，保育豬最低，在60%～65%之間，肥育豬開始回升到70%以上。2017—2018年肥育豬的PCV2抗體陽性率在70%左右，2019—2020年上升到90%，但整體上肥育豬抗體水平略低于其他豬群。不同年齡段豬群PRV-gB抗體陽性率均維持在較高水平。與其他豬群相比，經(jīng)產(chǎn)母豬和產(chǎn)房仔豬PRV-gE/gI抗體陽性率較高，另外公豬和肥育豬的抗體陽性率較低(圖3)。

圖2 2017—2020年浙江不同地區(qū)抗體檢測結(jié)果

圖3 2017—2020年不同日齡豬群抗體監(jiān)測結(jié)果

2.3 病原檢測結(jié)果對浙江省豬場臨床疑似病料進(jìn)行PRRSV、CSFV、PCV2、PRV的病原檢測。近4年來，PRRSV病原平均陽性率22.9%(450/1963)，CSFV病原平均陽性率2.5%(33/1334)，PCV2病原平均陽性率17.3%(247/1431)，PRV病原平均陽性率6.6%(108/1646)。

2.3.1PRRSV、CSFV、PCV2、PRV單一感染和混合感染情況 2017—2020年病毒單一感染和混合感染整體呈下降趨勢，特別2020年陽性率明顯下降。PRRSV單一感染在2019年最高，陽性率為35.5%，2020年最低，陽性率13.3%。CSFV的陽性率一直維持在較低水平，陽性率在5.5%～1.1%之間。PCV2和PRV的陽性率逐年降低?；旌细腥局蠵RRSV/PCV2雙重感染最高，陽性率為9.7%，其次是PRRSV/CSFV的雙重感染，此外，PRRSV/PRV和PCV2/PRV雙重感染、PRRSV/PCV2/PRV 三重感染和PRRSV/CSFV/PCV2/PRV四重感染均在2017與2018年有較低陽性率，2019與2020年均沒有檢測到(表3)。

2.3.2不同日齡豬病原檢測結(jié)果 對種豬、流產(chǎn)胎兒、產(chǎn)房仔豬、保育豬和肥育豬進(jìn)行PRRSV、CSFV、PCV2、PRV病原檢測。結(jié)果顯示：PRRSV、PCV2和CSFV病原保育豬的陽性率最高，2019年保育豬的PRRSV陽性率高達(dá)65.3%，平均陽性率為43.0%，2018年保育豬PCV2陽性率為38.8%，育肥豬次之，流產(chǎn)胎兒中陽性率最低。PRV病原在產(chǎn)房仔豬中陽性率最高，2017年產(chǎn)房仔豬PRV陽性率為22.2%，流產(chǎn)胎兒次之，保育豬PRV陽性率最低(圖4)。

表3 2017—2020年P(guān)RRSV、CSFV、PCV2、PRV單一感染和混合感染情況

圖4 2017—2020年不同日齡豬群病原檢測結(jié)果

3 討論

2017年開始，我國正式取消了PRRSV和CSFV的強(qiáng)制免疫計劃，實施“先打后補(bǔ)”政策試點，表明我國PRRSV和CSFV的防控工作取得了階段性勝利，也促使養(yǎng)殖企業(yè)更加注重免疫的合理性和科學(xué)性，提升豬場生物安全意識，建立綜合性的疫病防控體系，降低疫病發(fā)生風(fēng)險。

本研究對2017—2020年浙江地區(qū)不同豬場豬血清抗體進(jìn)行檢測，顯示4年來PRRSV、CSFV、PCV2、PRV-gE/gI、PRV-gB的抗體平均陽性率分別為81.4%，83.6%，91.4%，36.1%,94.3%,其中PRRSV和CSFV均達(dá)到了國家免疫方案中群體免疫抗體合格率≥70%的要求。與張樹金等[7]2015—2017年在山東地區(qū)CSFV、PRRSV和PRV的流行病學(xué)調(diào)查中結(jié)果相似。而本研究中病原檢測PRRSV、CSFV、PCV2和PRV的陽性率分別為22.9%，2.5%，17.3%,6.6%。與賀會利等[8]對2015—2017年廣西地區(qū)規(guī)?；i場的病原檢測結(jié)果較為一致。而汪志等[9]對2011—2015年華南地區(qū)規(guī)?；i場的病原檢測顯示，CSFV病原陽性率為42%以上，PCV2病原陽性率達(dá)到50%以上。本次檢測陽性率相比較低，原因可能是近幾年養(yǎng)殖場規(guī)?；潭葷u高，豬群疫苗免疫規(guī)范合理，豬場生物安全意識提高，整體發(fā)病率下降。

PRRS是規(guī)?；i場最重要的烈性傳染病之一。1987年美國首次分離到PRRSV以來，該病毒持續(xù)變異重組，流行毒株由高致病性毒株(HP-PRRSV)逐步演變?yōu)槟壳暗念怤ADC30毒株，且類NADC34、PRRSV 1-4-4等毒株不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致母豬高流產(chǎn)率，仔豬高死亡率，均對養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大影響[10-12]。2017—2020年浙江省PRRSV的病原檢測陽性率分別為21.6%，23.6%，35.5%,13.3%，波動比較大，其中2019年檢測陽性率較高。同時，PRRSV抗體水平在2019年最高，為85%左右，2020年下降到最低(70.8%)，其抗體水平維持較高水平，說明浙江省PRRSV疫苗免疫或者野毒感染十分普遍。PRRSV抗體水平的變化趨勢和其病原檢測陽性率的變化趨勢相一致，這可能與2018年非洲豬瘟暴發(fā)，大部分豬場改變或取消PRRSV免疫計劃有關(guān)。

CSFV在我國被列為5種優(yōu)先防制的“一類動物疫病”之一，具有高度傳染性。目前我國主要采取疫苗免疫接種措施預(yù)防豬瘟，常用的疫苗為豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株或HCLV株)，安全性和免疫原性較好，可以同時誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，能夠保護(hù)不同年齡豬抵抗豬瘟強(qiáng)毒的攻擊[13]。2017—2020年浙江省豬瘟抗體水平逐年穩(wěn)定上升，而病原檢測陽性率一直維持在5%以下，呈零星散發(fā)狀態(tài)，據(jù)回顧性調(diào)查暴發(fā)CSFV的豬場都存在免疫不到位或疫苗保存不當(dāng)而導(dǎo)致免疫失敗的問題。同時也說明CSFV的高水平抗體能有效阻止豬瘟野毒感染。

PCV2感染主要引起豬消瘦、生長緩慢、僵豬、飼料產(chǎn)出比下降、養(yǎng)殖成本增加、同時造成免疫抑制，導(dǎo)致PRRSV、PRV混合感染，副豬嗜血桿菌等繼發(fā)感染的機(jī)會[14]。2017—2018年P(guān)CV2抗體陽性率為89%，病原檢測陽性率在24%左右，而2019—2020年抗體陽性率提高到95%，病原檢測陽性率下降到10%左右。其原因可能是目前浙江省規(guī)?；i場普遍使用PCV2滅活疫苗，而PCV2抗體檢測試劑盒(愛德士公司)檢測的抗體無法區(qū)分是野毒感染后產(chǎn)生的抗體還是疫苗免疫抗體，導(dǎo)致本試驗中PCV2抗體有可能有一部分是野毒感染抗體。

2011年，PRV變異株的出現(xiàn)及流行，浙江省很多規(guī)模化豬場暴發(fā)豬偽狂犬病(PR)造成母豬流產(chǎn)、死胎，而現(xiàn)有疫苗不能提供完全保護(hù)，只能通過增加免疫次數(shù)和免疫劑量，以阻止PRV的侵襲[15]。PRV-gE/gI檢測野毒抗體，PRV-gB檢測疫苗免疫抗體或野毒感染抗體，2017—2020年P(guān)RV-gB抗體陽性率一直維持在92.0%以上，PRV-gE/gI抗體陽性率從40.0%逐年下降到2020年的20.3%，不同地區(qū)PRV-gE/gI抗體陽性率相差較大，同時浙江省PRV病原平均陽性率6.6%，說明目前部分種豬場已達(dá)到了PR的凈化，但也有很多豬場尚存在野毒感染，帶毒生產(chǎn)，特別是商品豬場PRV-gE/gI抗體陽性率較高。因此，建立合理的PRV免疫程序和生物安全措施,加強(qiáng)疫苗免疫，淘汰野毒抗體陽性母豬，并最終實現(xiàn)PR凈化。

對后備豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、產(chǎn)房仔豬、保育豬和肥育豬4種病毒的抗體檢測結(jié)果顯示保育豬抗體水平最低，而病原檢測結(jié)果顯示保育豬抗原陽性率最高。可能與保育豬階段母源抗體消失，而疫苗免疫抗體尚沒有上升，導(dǎo)致高發(fā)病率有關(guān)。將浙江省分為8個地區(qū)，區(qū)域間4種病毒的抗體水平變化較一致，說明抗體水平變化和區(qū)域關(guān)系不大。2017—2020年均檢測到混合感染，其中PRRSV/PCV2雙重感染最多，其次是PRRSV/CSFV、PRRSV/PRV、PCV2/PRV雙重感染，同時檢測到不同程度的PRRSV/PCV2/PRV三重感染、PRRSV/CSFV/PCV2/PRV四重感染，混合感染嚴(yán)重，情況復(fù)雜。這與鮑印等[16]在豫西南地區(qū)的檢測結(jié)果相一致。建議臨床工作者判斷主要病原感染同時，還應(yīng)考慮混合感染或繼發(fā)感染，加強(qiáng)混合感染的綜合措施，為我省規(guī)?；i場豬病毒病的防控提供了一定方向。

本研究通過對2017—2020年浙江省不同地區(qū)豬場主要病毒性疫病的流行病學(xué)調(diào)查分析，可知浙江省PRRSV、CSFV、PCV2和PRV感染仍具有普遍性，但從2019年開始，病毒檢測陽性率明顯下降，這可能與非洲豬瘟發(fā)生后豬場人員交叉減少，生物安全意識提高，疫病防控力度加大有關(guān)，同時也說明豬場在完善疫苗免疫，加強(qiáng)疫病抗體病原檢測以及持續(xù)做好生物安全措施的重要性。