李鵬飛，任俊華，蘇 滑，楊來福

(1.開封市中心醫(yī)院，河南 開封 475000;2.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453100)

腦卒中是一種驟然起病的腦循環(huán)障礙性疾病，已成為全世界第二大致死性疾病，且近年來在我國發(fā)病率逐漸上升[1]。資料顯示[2]，超過60 %的腦卒中患者存在認(rèn)知障礙，嚴(yán)重影響功能恢復(fù)及日常生活。研究表明[3-4]，腦卒中病理損傷后病灶周圍血管新生是形成新腦血管腦絡(luò)的基礎(chǔ)，且是決定缺血性神經(jīng)元存活的關(guān)鍵因素，有利于挽救缺血半暗帶，與認(rèn)知障礙程度密切相關(guān)。目前溶栓是臨床治療腦卒中的主要方式，但僅適用于時間窗內(nèi)患者，且副作用較大，因此探尋更為安全、有效的治療方式成為研究熱點(diǎn)。中醫(yī)傳統(tǒng)針刺治療承載著深厚的理論及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，已逐漸應(yīng)用于腦卒中治療，且效果良好，但關(guān)于其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚在探索階段[5-6]。本研究通過建立腦卒中大鼠模型，觀察百會、神庭電針干預(yù)對其認(rèn)知功能及血管新生的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 65只清潔級SD雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量190～210 g，購自北京華益健康藥物研究中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK(京)2019-0035。自由進(jìn)食、飲水，溫度24～26 ℃，自然光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)/一氧化氮(Nitricoxide，NO)通路抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)(上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司)；CD31免疫組化試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；兔抗鼠eNOS、p-eNOS和NO一抗，山羊抗兔IgG二抗(美國Santa cruz公司)；6805-D電針儀(汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司)；水迷宮裝置(北京碩林苑科技有限公司)；激光多普勒血流儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；RM2235病理切片機(jī)[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司]；Synergy-HD顯微鏡(日本Toshiba公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 采用改良Longa線栓法[7]。55只大鼠50 mg/kg ，2 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開左側(cè)頸部，鈍性分離肌群，游離頸總、內(nèi)和外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端、頸外動脈，夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)端，頸總動脈附近1 cm切口，插入尼龍線至頸內(nèi)動脈，深度20 mm，扎緊動脈殘端，常規(guī)縫合。大鼠清醒后單籠飼養(yǎng)，以Longa神經(jīng)功能評價(jià)方法評價(jià)其神經(jīng)功能:1分(提尾時左側(cè)前肢屈曲且不能伸展);2分(爬行時出現(xiàn)追尾表現(xiàn)或向左側(cè)劃圈);3分(爬行困難，向左側(cè)傾倒)提示建模成功;剔除0分(無明顯神經(jīng)功能缺失表現(xiàn))和4分(意識喪失，不能爬行)。剩余10只大鼠將阻塞線插入頸內(nèi)動脈深度約5 mm，剩余步驟同上，設(shè)為假手術(shù)組。40只大鼠造模成功，隨機(jī)分為腦卒中組、電針組、L-NAME組和電針+L-NAME組，各10只。

1.2.2 干預(yù)方式 膠帶粘牢大鼠前后肢。

1.2.2.1 電針組 采用百會、神庭電針干預(yù)，建模后24 h參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]確定百會及神庭穴位置，選用30號15 mm毫針，以30 °斜向刺入皮膚，深度2 mm左右，隨后采用電針儀，電壓峰值6 V，疏密波，頻率1/20 Hz，當(dāng)針體輕抖時即為得氣。20 min/次，1次/d，連續(xù)14 d。建模后1 h、12 h和36 h行生理鹽水腹腔注射，每次5 mg/kg

1.2.2.2 L-NAME組 在建模后1 h、12 h和36 h行L-NAME腹腔注射，每次5 mg/kg。

1.2.2.3 電針+L-NAME組 采用百會、神庭電針聯(lián)合L-NAME干預(yù)，操作同電針組與L-NAME組。

1.2.2.4 假手術(shù)組與腦卒中組 實(shí)施非穴刺激，取雙側(cè)肋下非穴、非經(jīng)位置：低于肋部且高于髂嵴15 mm，其余針刺操作同電針組。在建模后1 h、12 h和36 h行生理鹽水腹腔注射，每次5 mg/kg。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 末次干預(yù)后4 h開展Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。采用大鼠通用型圓形水迷宮裝置，水池120 cm×60 cm，水深25 cm，水溫23 ℃。將水池分為4個象限，第3象限中心放置高23 cm、直徑10 cm的圓形平臺。任選1象限面向池壁放入大鼠，記錄其60 s內(nèi)找到平臺的時間(逃避潛伏期)，超過60 s未找到平臺，記錄潛伏期為60 s，訓(xùn)練2次/d，每次間隔20 min，共持續(xù)5 d。第6天撤走平臺，將大鼠從原先象限對側(cè)入水，記錄逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時間和穿越原平臺次數(shù)。

1.2.4 檢測缺血局部腦血流量 戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，以俯臥位將其固定于腦立體定位儀上，前囟右旁開口約3 mm，后移3 mm鉆孔，直徑1 mm，暴露腦組織。采用醫(yī)用耳腦型膠將激光多普勒血流儀光纖探頭固定于腦立體定位儀上，與病灶側(cè)腦皮質(zhì)接觸，檢測中動脈供血區(qū)血流量，獲取腦血流速度。

1.2.5 組織取材 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及缺血局部腦血流檢測完成后，頸椎脫臼處死大鼠，剪開右心耳，心尖灌注100 mL預(yù)冷PBS，至肺、肝變白，右心房流出澄清液體，斷頭，取出完整腦組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗表面血液，其中5只沖掉表面血跡后濾紙吸干，用于檢測腦組織含水量，其余5只按照《大鼠腦立體定位圖譜》中定位方式切取患側(cè)海馬組織及腦皮質(zhì)組織[9]，濾紙吸干，海馬組織固定于4 %多聚甲醛中用于HE染色，腦皮質(zhì)組織分為2份，1份固定于4 %多聚甲醛中用于免疫組織化學(xué)染色，1份保存于液氮中用于Western blot檢測。

1.2.6 檢測腦組織含水量 取完整腦組織，天平稱重量，并記為濕重；隨后電熱恒溫干燥箱烘干腦組織至重量不再發(fā)生變化，天平稱重并記為干重。計(jì)算含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100 %。

1.2.7 HE染色觀察患側(cè)海馬區(qū)病理變化 取4 %多聚甲醛固定的腦組織，酒精梯度脫水、包埋，病理切片機(jī)制作成連續(xù)切片，厚度4 μm，二甲苯脫蠟、酒精水化，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察患側(cè)海馬區(qū)病理變化。

1.2.8 免疫組織化學(xué)染色觀察缺血周邊區(qū)域新生血管密度 取4%多聚甲醛固定48 h的患側(cè)腦皮質(zhì)組織，石蠟包埋，視交叉前緣切片(厚度8 μm)，采用CD31免疫組化試劑盒行染色標(biāo)記，DAB顯色試劑盒顯色15 min，蘇木精復(fù)染，經(jīng)二甲苯透明后封片。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取缺血周邊區(qū)域5個不相鄰視野，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞(細(xì)胞被染成棕黃色或黃色)，反映新生血管密度。

1.2.9 Western blot檢測腦組織eNOS、p-eNOS及NO蛋白相對表達(dá)量 取液氮保存的患側(cè)腦皮質(zhì)組織40 mg，充分研磨后轉(zhuǎn)移至離心管，RIPA裂解液冰上裂解，30 min后10 000 r/min，離心半徑8 cm離心15 min，BCA試劑盒定量蛋白后，將40 μg待檢測樣本混合2倍體積上樣緩沖液，沸水浴使蛋白變性，10 000 r/min，離心半徑8 cm離心15 min，取上清，恒壓下行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉液封閉2 h，與兔抗大鼠11 000 eNOS、p-eNOS及NO一抗(1∶1 000)混合，4 ℃搖床孵育過夜，TBST充分洗滌，與山羊抗兔IgG二抗(1:5 000)混合后室溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)顯色劑，暗室顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析灰度值，以eNOS、p-eNOS及NO/GADPH灰度值表示其蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組認(rèn)知功能比較

L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組、電針組和假手術(shù)組逃避潛伏期依次縮短，目標(biāo)象限停留時間依次延長，穿越原平臺次數(shù)依次增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組認(rèn)知功能比較

2.2 各組患側(cè)中動脈供血區(qū)腦血流速度、腦組織含水量比較

L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組、電針組和假手術(shù)組腦血流速度依次加快，腦組織含水量依次減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組患側(cè)中動脈供血區(qū)腦血流速度、腦組織含水量比較

2.3 HE染色觀察各組海馬區(qū)病理變化

假手術(shù)組神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)正常、核膜完整、核仁清晰和染色質(zhì)均勻分布；腦卒中組神經(jīng)元數(shù)量減少、排列紊亂和間隙變大，細(xì)胞核固縮、胞漿深染，可觀察到變性壞死神經(jīng)元；L-NAME組病理改變較腦卒中組更為嚴(yán)重；電針組、電針+L-NAME組干預(yù)后神經(jīng)元數(shù)量增加，核膜及核仁較清晰，損傷程度減輕，電針組較電針+L-NAME組改善效果更為明顯。見圖1。

2.4 各組新生血管密度比較

假手術(shù)組、L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組和電針組新生血管密度依次增加(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組新生血管密度比較

2.5 各組腦皮質(zhì)NO蛋白相對表達(dá)量、p-eNOS/eNOS比較

假手術(shù)組、L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組和電針組NO蛋白相對表達(dá)量、p-eNOS/eNOS依次升高(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 各組腦皮質(zhì)NO蛋白相對表達(dá)量、p-eNOS/eNOS比較

3 討論

腦卒中是一種腦血管阻塞或破裂導(dǎo)致血循障礙引起腦組織損傷的急性腦血管疾病。血管新生是指毛細(xì)血管自血管側(cè)支出芽、再塑，包括血管擴(kuò)張、增加內(nèi)皮通透性、溶解基底膜及內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移和形成管腔等多個連續(xù)環(huán)節(jié)，是腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵[10]。研究認(rèn)為[11]，盡管腦卒中后梗死區(qū)域可觀察到血管新生，但該代償機(jī)制難以滿足腦缺血所致腦損傷恢復(fù)的需要。因此，探究腦卒中后血管再生誘導(dǎo)方式，促進(jìn)缺血半暗帶側(cè)支循環(huán)建立，并尋找對應(yīng)靶點(diǎn)對于改善腦卒中預(yù)后至關(guān)重要。

腦卒中后認(rèn)知功能障礙屬于中醫(yī)“呆病”“癡癥”等范疇，以思維、判斷、記憶和執(zhí)行能力受損為主要表現(xiàn)，病位于腦，病機(jī)為腦脈痹阻、腦髓失養(yǎng)[12]。文獻(xiàn)指出[13]，督脈在經(jīng)絡(luò)聯(lián)系上屬腦，在病理表現(xiàn)上和腦部認(rèn)知功能密切相關(guān)，具有神、形共調(diào)的功效。百會穴屬督脈，與任脈交互，統(tǒng)督諸陽，可升可降，能補(bǔ)能瀉，補(bǔ)神益智、疏通腦絡(luò)和協(xié)調(diào)百脈。神為天部之氣，庭為聚散之所，神庭穴亦屬督脈，且是督脈、太陽和足陽明3條經(jīng)脈之會，有報(bào)道指出該穴可平喘降逆、寧神醒腦，是諸多醫(yī)家治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病時的要穴之一[14]。本研究結(jié)果中，與腦卒中組比較，電針組逃避潛伏期縮短，目標(biāo)象限停留時間延長，穿越原平臺次數(shù)增加，腦血流速度加快，腦組織含水量減少，海馬區(qū)病理變化減輕，且新生血管密度增加，提示電針百會、神庭穴可改善大鼠認(rèn)知功能、腦血流速度、腦水腫和病理變化，促進(jìn)血管新生。Liu等[15]研究顯示，百會、神庭電針干預(yù)腦卒中大鼠可預(yù)防缺血再灌注損傷，并減少缺血周圍區(qū)域神經(jīng)元凋亡。Wen等[16]認(rèn)為，百會、神庭電針持續(xù)14 d干預(yù)缺血性腦卒中大鼠后，其腦梗死體積縮小，且可通過激活海馬、扣帶回、前緣皮層和感覺皮層等認(rèn)知相關(guān)區(qū)域改善學(xué)習(xí)記憶能力，提示該治療方式在治療腦卒中時具有積極作用。

NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管生成必需調(diào)節(jié)因子，對內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖具有誘導(dǎo)作用，且可通過調(diào)節(jié)多種血管生成因子從而影響血管新生，促進(jìn)毛細(xì)血管管腔形成，其異常表達(dá)與血管再狹窄、動脈粥樣硬化、高血壓和腦卒中等心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。eNOS是NO生成過程中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)酶，兩者激活是腦缺血后適應(yīng)的延遲保護(hù)效應(yīng)，是自我保護(hù)機(jī)制之一。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，通過改善eNOS的解偶聯(lián)和激活eNOS/NO可改善缺血再灌注誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮通透性增強(qiáng)，從而修復(fù)血腦屏障，提示該通路在腦卒中進(jìn)程中的作用。此外，有動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[18]，Akt/eNOS被激活后，中腦動脈阻塞大鼠模型神經(jīng)功能、認(rèn)知功能均有所改善，神經(jīng)元凋亡減少，且血管生成增加，暗示該通路可能是治療腦卒中的潛在靶點(diǎn)之一。本研究結(jié)果顯示，采用eNOS/NO抑制劑L-NAME干預(yù)后，大鼠認(rèn)知功能、腦組織含水量、腦血流速度、新生血管密度及病理變化等改善效果均降低，且假手術(shù)組、L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組和電針組NO蛋白相對表達(dá)量、p-eNOS/eNOS依次升高，提示百會、神庭電針干預(yù)對腦卒中的治療效果可能通過調(diào)控p-eNOS、NO蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，百會、神庭電針干預(yù)可改善腦卒中大鼠認(rèn)知功能、腦水腫，加快腦血流速度，促進(jìn)血管新生，改善病理變化，推測其作用機(jī)制與促進(jìn)血管新生相關(guān)因子p-eNOS、NO表達(dá)有關(guān)。