于晨光，鄒 偉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.哈爾濱市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150000；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦病是指因遺傳、腦癱、腦出血、腦梗、化學(xué)藥物中毒和感染等引起腦神經(jīng)組織損傷，并造成腦功能障礙。腦是人體最為重要的器官之一，其血供占心輸出血量的15%左右，而耗氧量卻占全身耗氧的20%以上，所以對(duì)缺血缺氧的環(huán)境及其敏感，其中腦缺血以大腦中動(dòng)脈梗塞最為常見(jiàn)。腦缺血如果未在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血流供應(yīng)，那么腦組織的損傷和功能障礙會(huì)持續(xù)加重，甚至造成不可逆性的損傷。其損傷機(jī)制主要有氧化應(yīng)激損傷學(xué)說(shuō)、炎性反應(yīng)學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、神經(jīng)、血管再生學(xué)說(shuō)、腦水腫學(xué)說(shuō)等。腦組織損傷后，腦細(xì)胞的正常代謝被破壞，一系列應(yīng)激反應(yīng)被激活，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)和未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)，導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)或細(xì)胞死亡的重建，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的最終結(jié)果決定了細(xì)胞是存活還是經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的UPR在疾病中的重要作用機(jī)制已被深入研究[1]。ERS信號(hào)調(diào)節(jié)的時(shí)機(jī)可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生存和凋亡的平衡很重要，ERS最初是保護(hù)性的，旨在恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，而延長(zhǎng)的ERS可能有害[2]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，自噬主要有3種亞型:巨噬、微噬和伴侶介導(dǎo)的自噬[3]。ERS持續(xù)存在可以激活伴侶介導(dǎo)的自噬，受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可被自噬囊泡部分吞噬并降解，降解的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段可以重新組裝成新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而恢復(fù)其正常狀態(tài)[4]。本研究主要從ERS研究概況、ERS與自噬和凋亡的相互影響、針刺對(duì)ERS調(diào)控作用等方面進(jìn)行概述，以期為針刺方法治療腦病提供更多有效、可靠的依據(jù)。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究概況

1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種動(dòng)態(tài)的、膜結(jié)合的細(xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與核膜相連，并以網(wǎng)狀排列的連接囊和分支小管的形式延伸至整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)承載著合成各種脂類的代謝途徑，包括膽固醇、磷脂和中性脂類。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)的生產(chǎn)受到一系列機(jī)制調(diào)控，這些機(jī)制負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)分泌整合膜蛋白的折疊、修飾和展開(kāi)[5]。在真核細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)進(jìn)入分泌途徑的蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸過(guò)程至關(guān)重要[6]。為了維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，以ER為靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)被正確折疊是至關(guān)重要的。因?yàn)殄e(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，長(zhǎng)期積累可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性聚集物的形成[7]。只有完全正確的折疊蛋白才可能從ER轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，任何干擾氧化還原反應(yīng)的調(diào)控都會(huì)激活ERS。氧化應(yīng)激(Oxidative stress,OS)時(shí),UPR的激活是一個(gè)自適應(yīng)機(jī)制，用以維護(hù)細(xì)胞的存活和保障細(xì)胞的功能，持續(xù)的OS和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊會(huì)引起細(xì)胞凋亡這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8]。缺血性腦病影響腦細(xì)胞內(nèi)ATP以及PH值的波動(dòng)程度。通過(guò)破壞ATP依賴的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，引起線粒體內(nèi)鈣超載并激活OS和ERS。該病理過(guò)程影響線粒體的通透性，從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解和凋亡[9]。UPR是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，主要由3種ER跨膜蛋白控制。分別為蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇酶(IRE1)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF-6)。這3種蛋白共同監(jiān)測(cè)ER的蛋白折疊狀態(tài)，并啟動(dòng)糾正措施來(lái)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[10]。

1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡

凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式，機(jī)體通過(guò)這種形式維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。缺血性腦病發(fā)生后，由于腦部血供中斷引起神經(jīng)元出現(xiàn)損傷，從而走向不同的命運(yùn)：凋亡、壞死及自噬。凋亡主要分為內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)、外源性途徑(死亡受體途徑)和ERS誘導(dǎo)的凋亡這3種途徑[11]。ERS誘發(fā)自適應(yīng)性程序的啟動(dòng)，從而激活蛋白折疊。并掌控質(zhì)量控制機(jī)制以及降解途徑，同時(shí)也可以在損傷不可逆時(shí)激活細(xì)胞凋亡[12]。ERS初期，UPR可誘導(dǎo)啟動(dòng)IRE1、PERK和ATF6這3條信號(hào)通路，同時(shí)激活腦細(xì)胞的促生存模式。使腦細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下具有自我調(diào)節(jié)、自我修復(fù)的能力。但長(zhǎng)時(shí)間劇烈的ERS反而會(huì)激活凋亡[13]。非選擇性ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是多種疾病的重要致病因素。C/EBP同源蛋白(C/EBP Homologous Protein,CHOP)和肌醇必需酶1α(Inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)的激活可誘導(dǎo)應(yīng)激超負(fù)荷條件下的細(xì)胞凋亡[14]。

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬

自噬是一種保守的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑，保證了細(xì)胞內(nèi)和胞質(zhì)成分的降解、更替和更新[15]。神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)未折疊、不可溶解和受損的蛋白質(zhì)長(zhǎng)期積累，可誘發(fā)ERS和自噬[16]。自噬具有溶酶體介導(dǎo)的功能，可消除受損以及老化的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，對(duì)恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是必需的[17]。自噬通過(guò)將細(xì)胞質(zhì)部分隔離，形成以超微結(jié)構(gòu)為特征的雙層膜結(jié)合囊泡，該囊泡稱為自噬體。自噬體在與溶酶體相融合后,可對(duì)隔離胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器產(chǎn)生降解作用[18]。科學(xué)研究表明抑制自噬可放大腦缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷。而通過(guò)藥物刺激作用于自噬的方式，可提升腦組織對(duì)缺血再灌注的承受能力[19]。但自噬也被認(rèn)為是一把雙刃劍，過(guò)量地激活或抑制自噬會(huì)破壞大腦內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的穩(wěn)態(tài)，并在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[20]。ERS、自噬與凋亡之間存在常見(jiàn)的上游信號(hào)通路，包括PERK/ATF4、IRE1α、ATF6和Ca2+。自噬不僅可以通過(guò)抑制與凋亡相關(guān)的胱天蛋白酶的活化來(lái)阻斷凋亡的誘導(dǎo)，還可以誘發(fā)凋亡[21]。

1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與血管內(nèi)皮細(xì)胞

血管內(nèi)皮細(xì)胞通常附著在心、腦血管以及淋巴管內(nèi)表面單層扁平上皮，可以配合形成血管的內(nèi)壁。具有吞噬異物、壞死細(xì)菌或衰老組織的作用，還可參與機(jī)體免疫活動(dòng)。正常血管內(nèi)皮細(xì)胞在維護(hù)血管的通透性、調(diào)節(jié)血液與組織的交換、調(diào)節(jié)血管張力、調(diào)控炎性免疫反應(yīng)以及維持血流通暢等方面都發(fā)揮重要的作用[22]。研究表明[23]ERS通過(guò)激活OS與p38MAPK途徑可引起血管內(nèi)皮功能障礙。ER在腦組織缺血、缺氧以及氧化應(yīng)激時(shí)出現(xiàn)功能紊亂，表現(xiàn)為蛋白錯(cuò)誤表達(dá)、鈣超載等。同時(shí)激活OS過(guò)程，并造成腦損傷，所以ERS是引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的一種途徑[24]。

2 針刺對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控作用概況

2.1 針刺對(duì)PERK蛋白影響

PERK是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留跨膜蛋白激酶，可啟動(dòng)促凋亡和促生存信號(hào)通路[25]。PERK可以磷酸化真核細(xì)胞起始因子2α(eukaryoticinitiation factor 2α，elF2α)，從而抑制細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成。PERK還可以通過(guò)活化轉(zhuǎn)錄活化因子4從而上調(diào)CHOP蛋白的表達(dá)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程[26]。陳理軍等[27]選取健康成年樹(shù)鼩126只，通過(guò)頸動(dòng)脈交替夾閉制備腦損傷模型。用RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織PERK表達(dá)的變化，所選檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)為腦損傷后4 h、24 h和72 h。檢測(cè)結(jié)果表明樹(shù)鼩腦損傷可激活患側(cè)海馬ERS反應(yīng)，引起PERK蛋白表達(dá)增高。鄒偉等[28]選取Wistar大鼠120只，采用自體血注射的方式制備急性腦出血模型，針刺組用百會(huì)透刺曲鬢這一干預(yù)方法。分為空白對(duì)照組、模型組、針刺組、抑制劑+針刺組和自噬抑制劑組5組，每組24只，分為4個(gè)亞組(造模成功后12 h、1 d、3 d和7 d)。用Western Blot法分析血清PERK蛋白表達(dá)量的變化，用改良神經(jīng)缺損評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能的變化。結(jié)果表明,除了空白對(duì)照組外，其余各組PERK蛋白有明顯變化。其中6 h最低，7 d最高；相同時(shí)間點(diǎn)針刺組表達(dá)量最高，抑制劑組表達(dá)量最低；神經(jīng)功能缺損情況針刺組最輕，自噬抑制劑組最嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明百會(huì)透曲鬢針刺方法對(duì)急性腦病大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)具有積極作用?？商岣逷ERK蛋白表達(dá)量，從而起到腦保護(hù)以及神經(jīng)修復(fù)作用。

2.2 針刺對(duì)IRE1蛋白的影響

IRE1是一種ER跨膜傳感器，可激活UPR以維持ER穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞功能。盡管哺乳動(dòng)物的IRE1蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞存活，但也可以通過(guò)抗凋亡miRNA的降解來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[29]。IRE1激活可導(dǎo)致核糖核酸內(nèi)切酶的混雜活性，導(dǎo)致ER膜處的mRNA衰減，從而有助于減少蛋白質(zhì)負(fù)荷，這一過(guò)程被稱為調(diào)控IRE1依賴性衰減(RIDD)。不僅增加了細(xì)胞蛋白質(zhì)的折疊能力，還增加了蛋白質(zhì)降解和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，有助于減輕ER錯(cuò)誤折疊蛋白的影響[30]。IRE1的活化會(huì)激活自身核酸內(nèi)切酶的活性，剪切X-核結(jié)合蛋白1這一片段經(jīng)翻譯后入核，行使其轉(zhuǎn)錄因子功能并發(fā)揮UPR反應(yīng)的保護(hù)作用[31]。Gao Y L等[32]選用48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、毒品組和毒品+針刺組。后兩組均用毒品連續(xù)注射方式造成毒品依賴性腦病模型，毒品+針刺組增加電針(EA)這一干預(yù)手段。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶劃痕標(biāo)記法(TUNEL)觀察各組大鼠海馬和腹側(cè)被蓋區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。分別采用RT-PCR法和免疫組化法檢測(cè)IRE1、PERK、CHOP基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。結(jié)果表明電針+毒品組在IRE1、PERK和CHOP等蛋白表達(dá)水平均低于毒品組。說(shuō)明針灸具有調(diào)節(jié)ER穩(wěn)態(tài)作用，針刺對(duì)毒品成癮大鼠損傷神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。抑制CHOP的上調(diào)及減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是針刺對(duì)海洛因成癮腦損傷作用的主要機(jī)制。馬駿等[33]通過(guò)電針治療帕金森病模型大鼠，經(jīng)檢測(cè)得出針刺組大鼠黑質(zhì)內(nèi)IRE1α蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明電針風(fēng)府穴、太沖穴可以有效抑制與ERS相關(guān)的IRE1蛋白的活性。

2.3 針刺對(duì)ATF-6蛋白的影響

哺乳動(dòng)物肌醇需要酶1α(IRE1α)是所有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激傳感器中最為保守的，它包括轉(zhuǎn)錄激活因子ATF6和PERK。ATF6可以誘導(dǎo)XBP1 mRNA轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)特定基因的表達(dá)從而可以減輕ERS，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及抑制凋亡的出現(xiàn)[34]。吳家鵬等[35]選取40只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針(EA)組、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)組和EA+VEGF組(每組8只)。通過(guò)右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎的方式造成腦缺血性腦病模型。針刺組選穴為百會(huì)、曲池和足三里，每次30 min，持續(xù)治療14 d。對(duì)于VEGF組和EA+VEGF組的大鼠，成功建模后24 h將10 μL VEGF(0.025 μg/μL)注入側(cè)腦室。觀察指標(biāo)選用神經(jīng)系統(tǒng)缺損評(píng)分以及檢測(cè)各組大鼠腦組織AFT6、IRE1以及CHOP的蛋白表達(dá)水平。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EA和EA+VEGF改善大鼠神經(jīng)功能缺損優(yōu)于其他組，說(shuō)明EA可促進(jìn)腦組織修復(fù)；ERS相關(guān)蛋白ATF6、IRE1和CHOP蛋白表達(dá)方面，EA+VEGF組明顯低于其他組，說(shuō)明EA+VEGF的效果優(yōu)于單純EA和單純VEGF。

2.4 針刺對(duì)CHOP蛋白的影響

ERS情況下ATF6、IRE-1和PERK等蛋白的活化均對(duì)CHOP有誘導(dǎo)激活的調(diào)控作用，可增加其蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[36]。CHOP可稱為生長(zhǎng)停滯與DNA誘導(dǎo)損傷基因，屬于C/EBP家族的一員。CHOP通過(guò)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)和增強(qiáng)ROS的產(chǎn)物來(lái)發(fā)揮促凋亡作用[37]。CHOP是激活ERS并誘發(fā)凋亡的標(biāo)志性基因[38]。張慧等[39]對(duì)剛出生的SD大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng)10 d。然后再隨機(jī)分為正常細(xì)胞外液組、無(wú)Mg2+培養(yǎng)基組、針灸血清組和無(wú)針灸血清組4組(n=30)。使用五甲烯四氮唑制備急性驚厥SD大鼠血樣。通過(guò)針刺百會(huì)和大椎作為針刺干預(yù)手段連續(xù)針刺7 d，制備針灸血清。應(yīng)用Tunel法檢測(cè)針刺血清和非針刺血清在3 h、12 h和48 h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡情況，并分析CHOP蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明針刺血清能明顯減少海馬神經(jīng)元凋亡，可下調(diào)CHOP蛋白的表達(dá)，提示針刺對(duì)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)有積極作用。舒適[40]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,電針?biāo)疁涎▽?duì)腦神經(jīng)功能缺損大鼠的恢復(fù)有明確作用，其機(jī)制為調(diào)控ERS、減弱CHOP表達(dá)以及抑制自噬等方面共同發(fā)揮作用。

3 總結(jié)

近年來(lái)，凋亡、自噬和ERS在腦病防治方面的作用機(jī)制問(wèn)題受到廣泛關(guān)注。ERS初期是具有保護(hù)作用的，可以維持神經(jīng)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，但過(guò)量的激活卻又會(huì)激活凋亡、自噬程序。研究表明過(guò)量的激活可以啟動(dòng)自噬程序，可反向降低ERS水平，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。ERS與自噬、凋亡在動(dòng)態(tài)平衡下共同維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，從而降低腦病后繼發(fā)的破壞性反應(yīng)。本研究從研究針刺對(duì)PERK、IRE1、ATF-6及CHOP蛋白表達(dá)的影響著手，探究針刺對(duì)ERS與自噬、凋亡和氧化應(yīng)激等相互影響的調(diào)控機(jī)制，以期為針刺治療腦病提供理論依據(jù)。然而通過(guò)對(duì)ERS和腦病防治的相關(guān)性研究中也發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題：調(diào)控ERS治療腦病的靶點(diǎn)不明確；ERS如何與其他細(xì)胞器配合共同調(diào)控自噬、凋亡以及OS的機(jī)制尚不明確；ERS防治腦病多見(jiàn)于基礎(chǔ)理論分析以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn),少有臨床應(yīng)用的報(bào)道，說(shuō)明臨床尚未普及和推廣。因此，如何通過(guò)針刺方法或通過(guò)藥物干預(yù)手段減輕過(guò)度ERS以有效對(duì)抗血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、自噬或?qū)⒊蔀槲磥?lái)該領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。希望本研究能為針刺調(diào)控ERS治療腦病這一方法提供更多的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)以及理論支撐。