李紹康,和婧偉,趙 潔,曹曉雯,劉陟清,朱 森

(1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院，上海 200135; 2.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海 201102)

腰椎間盤突出癥(Lumbar disc herniation，LDH)是在腰椎間盤退變的基礎(chǔ)上，髓核突出、纖維環(huán)破裂，對神經(jīng)根及馬尾神經(jīng)造成壓迫、刺激導(dǎo)致腰腿痛和坐骨神經(jīng)痛的一種臨床綜合征[1]。目前LDH治療方式包括手術(shù)治療、非手術(shù)治療，手術(shù)治療風(fēng)險高、創(chuàng)傷大，患者接受度低，非手術(shù)治療包括藥物口服、推拿和封閉療法等，多數(shù)患者在非手術(shù)治療情況下癥狀能得到有效緩解[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，突出椎間盤及骨贅形成導(dǎo)致的機(jī)械性壓迫，以及受壓神經(jīng)根或炎性侵入性細(xì)胞所自發(fā)分泌的多種因子及神經(jīng)肽類物質(zhì)引發(fā)的非特異性炎癥反應(yīng)，均是導(dǎo)致患者出現(xiàn)腰腿痛的重要原因。針灸是常見的中醫(yī)保守干預(yù)方式，臨床已有關(guān)于其治療神經(jīng)病理性疼痛的研究，可有效減輕患者疼痛、提升其生活質(zhì)量，且安全性高[5]。然而，目前鮮有關(guān)于針灸對LDH腰受損神經(jīng)根組織炎癥反應(yīng)的影響及具體機(jī)制的報道。鑒于此，本研究通過建立腰神經(jīng)根受壓大鼠模型，觀察針灸對其疼痛癥狀及腰受損神經(jīng)根組織炎癥反應(yīng)的影響，并探討相關(guān)機(jī)制，以期指導(dǎo)腰椎間盤突出癥的臨床治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只SD大鼠，雄性，SPF級，7周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，使用許可證號：SYXK(滬)2019-0032。大鼠購入后飼養(yǎng)于清潔、通風(fēng)環(huán)境，溫度(23±2)℃，濕度(60±5)%，明暗周期12 h/12 h循環(huán)。

1.2 藥物與試劑

布洛芬緩釋膠囊(上海信誼天平藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H31022720,0.3 g)；戊巴比妥鈉(上海信裕生物科技有限公司)；白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(上海谷研實業(yè)有限公司)；Trizol試劑盒、全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；兔抗大鼠Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)多抗、髓樣細(xì)胞分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear transcription factor κB，NF-κB)單抗(美國Abcam公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器

RS-6687手術(shù)放大鏡(深圳市澤拓生物科技有限公司)；大鼠柔性固定器(溫州原上草醫(yī)療科技有限公司)；熱痛測試儀(美國IITC Life Science公司)；Synergy H4全功能酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)；EG1150分體式包埋機(jī)、SM2010R切片機(jī)(德國LeicaMicrosystems貿(mào)易有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型建立及分組 參考文獻(xiàn)[6]建立大鼠腰神經(jīng)根受壓模型。取50只SD大鼠，戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，除去背部毛發(fā)，俯臥位固定于操作臺，常規(guī)消毒、鋪巾。以L4～5棘突間隙為中心，后背正中切口，長度約4 cm，逐層分離皮膚、皮下組織，自動牽鉤拉開，咬骨鉗將右側(cè)L4～5棘突、關(guān)節(jié)突及椎板咬除，在手術(shù)放大鏡探查下充分暴露右側(cè)L5神經(jīng)根及馬尾神經(jīng)，將2 mm×2 mm×1 mm特制硅膠片置于酒精中消毒2 h后填塞入右側(cè)L5神經(jīng)根硬膜囊腋部，固定后常規(guī)縫合，切口處涂抹金霉素軟膏，注射8萬U青霉素以預(yù)防感染，連續(xù)3 d。10只大鼠僅切開皮膚與椎旁肌，設(shè)為假手術(shù)組。術(shù)后大鼠蘇醒后放回籠中觀察3 d，建模成功標(biāo)準(zhǔn)：右側(cè)下肢腫脹，行走時右足外翻甚至間歇性跛行。將建模成功的31只大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)、針灸組(10只)和陽性藥物組(11只)。

1.4.2 干預(yù)方式 確定建模成功將大鼠分組后即建模后第4天開始干預(yù)。針灸組選取L5受壓神經(jīng)根右側(cè)夾脊穴，參照《實驗針灸學(xué)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行穴位定位[7]，將大鼠固定后，選取0.25 mm×13 mm華佗牌針灸針，針刺深度為5 mm，留置20 min，1次/d；假手術(shù)組與模型組每天僅固定20 min，不實施針灸；陽性藥物組采用布洛芬緩釋膠囊60 mg/(kg·d)灌胃，每天早晚分2次干預(yù)。干預(yù)時間為21 d。

1.4.3 熱痛閾值測定 干預(yù)前、干預(yù)后7 d、14 d和21 d采用熱痛測試儀測定大鼠熱痛閾值，光源輻射點對準(zhǔn)大鼠左側(cè)后足底部正中位置，待其出現(xiàn)舔后足時結(jié)束計時，該段時間(s)即為熱痛閾值。光源輻射最長時間為25 s，防止損傷大鼠足底。每次重復(fù)測試3次，間隔5 min，取平均值。

1.4.4 組織取材 末次測定熱痛閾值后4 h脫頸處死大鼠，暴露右側(cè)L5神經(jīng)根，冰盤上迅速剖開切取受壓神經(jīng)根，每組隨機(jī)選取5只大鼠受壓神經(jīng)根組織迅速置于40%中性甲醛固定備用，5只大鼠受壓神經(jīng)根組織保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 ELISA法測定腰受損神經(jīng)根組織IL-6、TNF-α及IL-1β濃度 取冷凍保存的腰受損神經(jīng)根組織50 mg，與1 mL PBS混合，勻漿器10 000 r/min離心10 min勻漿，離心半徑10 cm，取上清，采用ELISA法測定組織中IL-6、TNF-α及IL-1β濃度，嚴(yán)格根據(jù)IL-6、TNF-α及IL-1β ELISA試劑盒說明書設(shè)計操作步驟，經(jīng)酶標(biāo)儀讀取波長570 nm處吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計算各因子濃度。

1.4.6 HE染色觀察腰受損神經(jīng)根病理變化 取40%中性甲醛固定備用的受壓神經(jīng)根組織，酒精梯度脫水、石蠟包埋，制作成5 μm厚度連續(xù)切片，取切片二甲苯脫蠟、酒精水化，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察腰受損神經(jīng)根病理變化。

1.4.7 QRT-PCR法測定腰受損神經(jīng)根組織TLR4、MyD88、NK-κBp65 mRNA表達(dá)量 取冷凍保存的腰受損神經(jīng)根組織50 mg，經(jīng)Trizol試劑盒提取總RNA，測定RNA純度及濃度后，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，經(jīng)產(chǎn)物鑒定后行QRT-PCR。設(shè)計反應(yīng)體系及反應(yīng)條件時嚴(yán)格按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行：5 μL 10×buffer，dNTP 0.4 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 4 μL，Taq酶5 μL，dd H2O 3.6 μL，總反應(yīng)體系20 μL；96 ℃預(yù)變性10 min，96 ℃變性30 s，60 ℃退火10 s，70 ℃延伸60 s，40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參對照，采用2-△△CT計算目的基因的相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.4.8 Western blot法測定腰受損神經(jīng)根組織TLR4、MyD88及NK-κBp65蛋白表達(dá)量 取冷凍保存的腰受損神經(jīng)根組織50 mg，冰上勻漿，離心后取上清液，按照全蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒說明書分別進(jìn)行總蛋白的提取及定量，沸水浴5 min變性，取40 μg待測樣本混合等量上樣緩沖液，制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，電泳恒壓分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入1∶1 000稀釋的TLR4多抗，MyD88、NK-κBp65單抗，洗膜后，加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，洗膜后，加入ECL發(fā)光液，暗室中顯影、定影，采用Image J軟件分析，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的基因蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)前后各組熱痛閾值比較

干預(yù)后7 d、14 d和21 d與假手術(shù)組比較，模型組、針灸組和陽性藥物組熱痛閾值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后7 d、14 d和21 d與模型組比較，針灸組、陽性藥物組熱痛閾值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后7 d、14 d和21 d與針灸組比較，陽性藥物組熱痛閾值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與干預(yù)前比較，假手術(shù)組干預(yù)后7 d、14 d和21 d熱痛閾值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與干預(yù)前比較，模型組干預(yù)后7 d、14 d和21 d熱痛閾值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與干預(yù)前比較，針灸組干預(yù)后7 d熱痛閾值降低，干預(yù)后21 d熱痛閾值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)后14 d與干預(yù)前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與干預(yù)前比較，陽性藥物組干預(yù)后7 d疼痛閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，干預(yù)后14 d、21 d熱痛閾值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)后7 d、14 d和21 d呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 干預(yù)前各組熱痛閾值比較

2.2 各組腰受損神經(jīng)根組織IL-6、TNF-α和IL-1β濃度比較

與假手術(shù)組比較，模型組、針灸組和陽性藥物組腰受損神經(jīng)根組織IL-6、TNF-α和IL-1β濃度均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針灸組、陽性藥物組腰受損神經(jīng)根組織IL-6、TNF-α和IL-1β濃度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與針灸組比較，陽性藥物組腰受損神經(jīng)根組織IL-6、TNF-α和IL-1β濃度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組腰受損神經(jīng)根組織IL-6、TNF-α及IL-1β濃度比較

2.3 各組腰受損神經(jīng)根組織病理變化觀察

HE染色顯示，假手術(shù)組細(xì)胞密度均勻，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)中可觀察到顆粒狀物均勻排列；模型組腰受損神經(jīng)根中神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核發(fā)生不規(guī)則變化，核仁模糊，細(xì)胞漿發(fā)生空泡樣改變，胞漿中可觀察到顆粒狀物不均勻排列；針灸組與陽性藥物組經(jīng)干預(yù)后上述病理變化有所改善，部分神經(jīng)元細(xì)胞可觀察到核偏移，核仁較清晰，細(xì)胞質(zhì)密度較均勻，且陽性藥物組改善優(yōu)于針灸組。見圖1。

2.4 各組腰受損神經(jīng)根組織TLR4、MyD88、NK-κB p65 mRNA表達(dá)量比較

與假手術(shù)組比較，模型組、針灸組和陽性藥物組TLR4、MyD88和NK-κB p65 mRNA表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針灸組、陽性藥物組TLR4、MyD88和NK-κB p65 mRNA表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與針灸組比較，陽性藥物組TLR4、MyD88和NK-κB p65 mRNA表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組腰受損神經(jīng)根組織TLR4、MyD88、NK-κB p65 mRNA表達(dá)量比較

2.5 各組腰受損神經(jīng)根組織TLR4、MyD88及NK-κB p65蛋白表達(dá)量比較

與假手術(shù)組比較，模型組、針灸組和陽性藥物組TLR4、MyD88及NK-κB p65蛋白表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針灸組、陽性藥物組TLR4、MyD88及NK-κB p65蛋白表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與針灸組比較，陽性藥物組TLR4、MyD88和NK-κB p65蛋白表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5和圖2。

表5 各組腰受損神經(jīng)根組織TLR4、MyD88、NK-κB p65蛋白表達(dá)量比較

3 討論

隨著生活、工作方式的轉(zhuǎn)變及老齡化社會進(jìn)程的加快，LDH已成為臨床常見病，其以反復(fù)坐骨神經(jīng)痛及腰痛為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者生活與工作。目前臨床認(rèn)為LDH的發(fā)病與腰椎間盤退行性變導(dǎo)致的無菌性炎癥、腰椎間盤突出形成的機(jī)械性壓迫、免疫反應(yīng)、急性或慢性損傷等密切相關(guān)，以椎間盤組織失去正常髓核及纖維環(huán)結(jié)構(gòu)、組織破壞、纖維排列松散、灶性炎癥細(xì)胞浸潤及血管化等為主要病理改變[8-9]。因此，緩解LDH受壓神經(jīng)根疼痛、減輕炎癥反應(yīng)是治療該病的關(guān)鍵。

既往報道顯示[10-11]，腰椎神經(jīng)根機(jī)械性受壓并非導(dǎo)致神經(jīng)根性疼痛、機(jī)能障礙的唯一原因，同時炎癥介質(zhì)也是誘發(fā)神經(jīng)根性疼痛及化學(xué)性神經(jīng)炎的關(guān)鍵因素。隨著研究的逐漸深入，IL-6、TNF-α和IL-1β等致炎因子在突出的椎間盤組織中被發(fā)現(xiàn)，成為反映炎癥反應(yīng)程度的可靠指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后各時間點模型組、針灸組、陽性藥物組和假手術(shù)組熱痛閾值依次升高，腰受損神經(jīng)根組織IL-6、TNF-α和IL-1β濃度均依次降低，提示針灸可提升腰神經(jīng)根受壓大鼠熱痛閾值，減輕炎癥反應(yīng)；HE染色顯示，模型組腰受損神經(jīng)根中神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核不規(guī)則變化，核仁模糊，細(xì)胞漿空泡樣改變，針灸組與陽性藥物組經(jīng)干預(yù)后上述病理變化有所改善，提示針灸可減輕大鼠腰受損神經(jīng)根病理改變。中醫(yī)認(rèn)為[12-13]，LDH屬“痹證”“腰痛”等范疇，肝腎虧虛為本，風(fēng)寒濕熱為標(biāo)，氣滯血瘀、經(jīng)脈失養(yǎng)，治療關(guān)鍵在于通絡(luò)活血、化瘀鎮(zhèn)痛。夾脊穴內(nèi)夾督脈，外臨膀胱經(jīng)，通過“督脈之別”使督脈和膀胱經(jīng)得以發(fā)揮作用，且與脾、胃等臟腑背俞相鄰。針刺夾脊穴可直達(dá)病灶，起到調(diào)和臟腑氣血、疏通經(jīng)絡(luò)脈道的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)證實[14]，針灸可刺激腦腓肽神經(jīng)元與興奮神經(jīng)粗纖維，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果；促進(jìn)針刺周圍血管擴(kuò)張，增加局部血流量，改善微循環(huán)，減輕受壓神經(jīng)根炎癥浸潤所致的充血與水腫。張寒等[15]采用針刺治療LDH大鼠模型，可減輕其疼痛，改善運(yùn)動障礙，本研究結(jié)論與其具有相似性。

TLRs/MyD88信號通路是生物進(jìn)化中重要的炎癥反應(yīng)介導(dǎo)通路。TLR4通過識別外源性配體或內(nèi)源分子，與Toll-白細(xì)胞介素-1受體同源區(qū)互相作用發(fā)生二聚化，激活下游MyD88后通過胞內(nèi)信號傳導(dǎo)最終激活NF-κB信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α及IL-1β等細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥生物學(xué)效應(yīng)。既往動物研究顯示[16]，柴胡提取物可通過TLRs信號通路減輕羅非魚炎癥損傷，提示該通路在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中具有重要作用。陳秋欣等[17]采用針刺治療急性腦出血大鼠時發(fā)現(xiàn)，針刺可能通過負(fù)調(diào)控TLRs/MyD88信號通路減輕腦出血后炎性損傷，保護(hù)腦組織。此外，梁英業(yè)[18]研究證實，下調(diào)TLRs/MyD88信號通路可有效減少炎癥因子釋放，從而達(dá)到治療神經(jīng)病理性疼痛的目的。本研究結(jié)果顯示，模型組、針灸組、陽性藥物組和假手術(shù)組TLR4、MyD88、NK-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)量依次降低，提示針灸對腰神經(jīng)根受壓大鼠疼痛、炎癥反應(yīng)和病理變化的改善作用可能通過抑制TLR4/MyD88信號通路實現(xiàn)。

綜上所述，針灸可有效減輕腰神經(jīng)根受壓模型大鼠疼痛，抑制炎癥反應(yīng)，改善腰受損神經(jīng)根病理變化，推測其作用機(jī)制與下調(diào)TLR4、MyD88、NK-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)、抑制TLR4/MyD88信號通路有關(guān)，為臨床該病治療提供理論基礎(chǔ)。關(guān)于針灸治療腰神經(jīng)根受壓時是否存在其他調(diào)控機(jī)制仍需深入探討。