郭慶敏 孟旭霞 楊堃 余川

1青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科 266000；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 266000；3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科 450052

郭慶敏現(xiàn)在河北省眼科醫(yī)院 河北省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北省眼部疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，邢臺(tái)054001

Notch信號(hào)通路是一條進(jìn)化上高度保守、通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)通路[1]。Notch的配體Delta樣配體4(Delta-like 4，Dll4)和Jagged1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并在血管發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2]。有研究證實(shí)Jagged1不僅能促進(jìn)腫瘤血管生成，還可通過(guò)拮抗Dll4/Notch信號(hào)通路發(fā)揮較強(qiáng)的血管生成調(diào)節(jié)作用[3-6]。增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是以眼底新生血管形成為主要病理改變的眼底病變，Jagged1是否參與人類(lèi)PDR新生血管的發(fā)生尚不清楚。本研究擬檢測(cè)PDR患眼纖維血管膜病理標(biāo)本中Jagged1、Dll4和Notch1的表達(dá)，探討Jagged1在PDR新生血管形成中的作用及其與Dll4/Notch信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源及分組 于2014年7月至2015年7月收集在青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科行睫狀體扁平部23G標(biāo)準(zhǔn)三通道玻璃體切割手術(shù)的PDR患者57例60眼術(shù)中纖維血管膜標(biāo)本，其中男32例34眼，女25例26眼；年齡36～73歲，平均(54.93±6.42)歲；糖尿病病程8～20年，平均(15.72±3.51)年。所有患者均符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)及PDR診斷標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：肺部疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、心腦血管病變、惡性腫瘤及自身免疫性疾病患者。根據(jù)術(shù)前是否行抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物玻璃體內(nèi)注射將標(biāo)本分為未注藥組30例32眼和注藥組27例28眼，各組年齡和性別構(gòu)成比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.642、3.964，均P>0.05)，注藥組于玻璃體切割術(shù)前2～7 d行雷珠單抗玻璃體內(nèi)注射。同期選取特發(fā)性黃斑前膜患者18例18眼術(shù)中黃斑前膜標(biāo)本作為對(duì)照組，排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有糖尿病及糖尿病家族史者；(2)有眼部及全身感染、急性炎癥反應(yīng)及缺血缺氧性疾病史以及全身系統(tǒng)性疾病者。本實(shí)驗(yàn)中未注藥組和注藥組患者控制血糖的全身用藥種類(lèi)相同或相似，且均無(wú)其他全身用藥；所有患者術(shù)前均采用相同的質(zhì)量濃度0.5%左氧氟沙星滴眼液(日本參天制藥有限公司)點(diǎn)眼清潔結(jié)膜囊，減輕眼部炎癥反應(yīng)，以確保組間患者基線資料均衡。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批文號(hào)：QYFYWZLL25645)，所有患者或其家屬術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2主要試劑及儀器 兔抗Notch1(ab52627，英國(guó)Abcam公司)；鼠抗Dll4(A00875-1)、兔抗Jagged1(A00901-4)、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(BA1003)(武漢博士德生物工程有限公司)。手術(shù)顯微鏡(VISU200p，德國(guó)Carl Zeiss公司)；Constellation玻璃體切割機(jī)(美國(guó)Alcon公司)；高速離心機(jī)(Allegra X-22，美國(guó)Beckman公司)；微量移液器(P4608-200°，美國(guó)Labnet公司)；熒光定量PCR系統(tǒng)(Light Cycler 96，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；光學(xué)顯微鏡(DM6B)、石蠟切片機(jī)(RM2235)(德國(guó)Leica公司)；紫外分光光度計(jì)(DR6000，美國(guó)哈希公司)。

1.2 方法

1.2.1組織病理學(xué)染色觀察各組標(biāo)本結(jié)構(gòu)特征 取未注藥組新鮮標(biāo)本10個(gè)、注藥組新鮮標(biāo)本12個(gè)和對(duì)照組標(biāo)本8個(gè)，置于質(zhì)量濃度4%多聚甲醛溶液中固定5 h，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，沿標(biāo)本最大截面處行3 μm厚連續(xù)切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本的組織結(jié)構(gòu)。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組標(biāo)本中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白表達(dá) 選取1.2.1部分的石蠟切片，每個(gè)病理標(biāo)本選取截面最大處連續(xù)切片15張，各選取5張按照免疫組織化學(xué)試劑盒操作步驟進(jìn)行Jagged1、Dll4和Notch1蛋白的免疫組織化學(xué)染色。具體步驟為將3 μm厚組織切片置于60 ℃恒溫烤片箱中烤片1 h；將切片浸于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5 min進(jìn)行脫蠟，梯度乙醇進(jìn)行水化和除去二甲苯，自來(lái)水沖洗，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗2次，每次5 min；滴加體積分?jǐn)?shù)3% H2O2室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加抗原修復(fù)液，室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加山羊血清封閉液，37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育20 min，甩去多余液體；滴加稀釋后的Jagged1、Dll4和Notch1一抗(均1∶ 100稀釋)，37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育2.5 h。0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標(biāo)記二抗(1∶ 50稀釋)，室溫孵育15 min。0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃恒溫箱中孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色3 min，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。采用Image pro plus 6.0軟件計(jì)算每張切片中陽(yáng)性染色區(qū)域的平均吸光度(A)值，以各組病理標(biāo)本中蛋白表達(dá)的平均值作為相應(yīng)蛋白的表達(dá)量。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定標(biāo)本中Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA的表達(dá) 分別取未注藥組標(biāo)本22個(gè)、注藥組標(biāo)本16個(gè)和對(duì)照組標(biāo)本10個(gè)，置于消毒的離心管中，-80 ℃超低溫冰箱中凍存。取50～100 mg標(biāo)本置于玻璃管中，加入1 ml RNAiso plus裂解液，提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量濃度和純度，取A260/A280為1.7～2.1的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用雙鏈嵌合熒光染色法擴(kuò)增相應(yīng)基因。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成。Jagged1引物：正向5’-AACTGGTACCGGTGCGAA-3’，反向5’-TGATGCAAGA TCTCCCTGAAAC-3’；Dll4引物：正向5’-CCCTGGC AATGTACTTGTGAT-3’，反向5’-TGGTGGGTGCAGTA GTTGAG-3；Notch1引物：正向5’-GTCAACGCCGTAG ATGACC-3’，反向5’-TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG-3’；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物：正向5’-CACGATGGA GGGGCCGGACTCATC-3’，反向5’-TAAAGACCTCTA TGCCAACACAGT-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogoror-Smimor檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。未注藥組、注藥組和對(duì)照組標(biāo)本間Jagged1、Dll4和Notch1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。PDR纖維血管膜標(biāo)本中Jagged1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與Dll4和Notch1 mRNA表達(dá)量關(guān)系評(píng)估采用Pearson線性相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組標(biāo)本中組織病理學(xué)表現(xiàn)

光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)PDR纖維血管膜中新生血管生成，注藥組纖維血管膜中血管管腔狹窄，部分管腔閉合；未注藥組纖維血管膜中血管管腔充盈，且形態(tài)較完整；對(duì)照組黃斑前膜組織疏密均勻，未見(jiàn)新生血管結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 各組病理標(biāo)本中新生血管情況(HE ×100，標(biāo)尺=100 μm) A：未注藥組纖維血管膜中可見(jiàn)新生血管管腔充盈(箭頭) B：注藥組纖維血管膜中血管管腔狹窄(箭頭) C：對(duì)照組黃斑前膜中未見(jiàn)新生血管Figure 1 Neovascularization in pathological specimens of each group(HE ×100,bar=100 μm) A:Dilated lumen (arrow) of new blood vessels was found in fibrovascular membranes of the non-injection group B:Narrow lumen (arrow) of new blood vessels was found in fibrovascular membranes of the injection group C：No neovascularization was found in macular epiretinal membranes of the control group

2.2 未注藥組與注藥組標(biāo)本中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白的表達(dá)比較

未注藥組10個(gè)標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白表達(dá)均呈強(qiáng)陽(yáng)性，主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性細(xì)胞主要位于新生血管內(nèi)皮組織，而非血管內(nèi)皮部位的陽(yáng)性染色考慮主要在切片及標(biāo)本制作過(guò)程中，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞被牽拉移位至血管外部位所致；注藥組12個(gè)標(biāo)本血管內(nèi)皮細(xì)胞中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白表達(dá)均呈弱陽(yáng)性(圖2)。未注藥組纖維血管膜病例標(biāo)本中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白陽(yáng)性區(qū)域平均A值明顯高于注藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.168，P=0.014；t=6.012，P=0.008；t=3.453，P=0.030)(表1)。

圖2 未注藥組及注藥組纖維血管膜病理標(biāo)本中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白免疫組織化學(xué)染色圖(DAB ×400，標(biāo)尺=50 μm) 未注藥組纖維血管膜中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，注藥組纖維血管膜中各蛋白表達(dá)減弱 箭頭所示為染色陽(yáng)性細(xì)胞Figure 2 Immunohistochemical staining images of Jagged1,Dll4 and Notch1 proteins in specimens of the two groups(DAB ×400,bar=50 μm) Strong positive expression of Jagged1,Dll4 and Notch1 proteins could be seen in the non-injection group,and attenuated expression of the three proteins was found in the injection group Arrows indicated the positively stained cells

表1 未注藥組與注藥組Jagged1、Dll4和Notch1蛋白免疫組織化學(xué)陽(yáng)性染色平均A值比較(mean±SD)Table 1 Comparison of the average absorbance value of Jagged1,Dll4 and Notch1 between the two groups (mean±SD)組別樣本量陽(yáng)性染色A值Jagged1Dll4Notch1未注藥組106.25±1.826.87±1.895.12±2.14注藥組121.46±0.371.55±0.241.32±0.53t值5.1686.0123.453P值0.0140.0080.030 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) Dll4:Delta樣配體4 Note:(Independent samples t-test) Dll4:Delta-like 4

2.3 各組標(biāo)本Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA的表達(dá)比較

對(duì)照組、注藥組和未注藥組標(biāo)本中Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77.337、62.305、51.869，均P<0.01)；其中，未注藥組和注藥組標(biāo)本中Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，注藥組Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于未注藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

表2 各組Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative expression levels of Jagged1,Dll4 and Notch1 mRNA among the three groups (mean±SD)組別樣本量各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Jagged1Dll4Notch1對(duì)照組101.89±0.182.20±0.751.24±0.17未注藥組2221.33±2.22a38.85±11.34a9.91±2.33a注藥組167.56±0.49ab10.24±1.36ab4.67±1.19abF值77.33762.30551.869P值<0.01<0.01<0.01 注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與未注藥組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Dll4:Delta樣配體4 Note:Compared with the control group, aP<0.05;compared with the non-injection group, bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) Dll4:Delta-like 4

2.4 PDR患者纖維血管膜標(biāo)本中Jagged1與Dll4 mRNA和Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性

所有PDR患者纖維血管膜標(biāo)本中Jagged1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與Dll4和Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈顯著正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.925、0.950，均P<0.05)(圖3)。

圖3 PDR患者纖維血管膜標(biāo)本中Jagged1與Dll4和Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量相關(guān)分析散點(diǎn)圖(Pearson線性相關(guān)分析，n=38) A：Jagged1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與Dll4 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.925，P<0.05) B：Jagged1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.950，P<0.05) Dll4：Delta樣配體4Figure 3 Scatter diagram of the relative expression levels of Jagged1,Dll4 and Notch1 mRNA in fibrovascular membrane specimens from PDR patients(Pearson linear correlation analysis，n=38) A:The relative expression level of Jagged1 mRNA was positively correlated with that of Dll4 mRNA (r=0.925，P<0.05) B：The relative expression level of Jagged1 mRNA was positively correlated with that of Notch1 mRNA (r=0.950,P<0.05) Dll4:Delta-like 4

3 討論

糖尿病是一種常見(jiàn)的慢性疾病，約有70%的患者會(huì)并發(fā)全身小血管和微血管病變，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見(jiàn)的眼底微血管并發(fā)癥[9-10]。PDR可繼發(fā)玻璃體反復(fù)積血、纖維增生，繼而形成纖維條索，甚至出現(xiàn)牽拉性視網(wǎng)膜脫離，嚴(yán)重者可致盲[11]。

作為Notch信號(hào)通路的配體之一，Jagged1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管的生成和發(fā)育，其基因突變將導(dǎo)致Alagile綜合征，表現(xiàn)為嚴(yán)重的血管缺陷[12]，而卵巢癌及三陰乳腺癌的血管形成與Jagged1的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)[13-15]。Guo等[16]對(duì)2型糖尿病模型大鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可通過(guò)激活Jagged1-Notch1信號(hào)通路誘導(dǎo)腦部新生血管生成；而Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450 2J2可通過(guò)激活Jagged1/Notch1信號(hào)通路促進(jìn)心肌血管形成，進(jìn)而改善心衰患者的心功能狀況。本研究結(jié)果顯示，Jagged1在PDR患者纖維血管膜中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，考慮可能由于黃斑前膜組織無(wú)新生血管的形成和出芽，而注藥組由于玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物，造成部分視網(wǎng)膜新生血管消退萎縮，因此其Jagged1表達(dá)量較未注藥組低。此外，本研究結(jié)果顯示Jagged1與Notch1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，推測(cè)Jagged1與Notch1聯(lián)合發(fā)揮調(diào)控新生血管生成的作用。

有研究證實(shí)，Jagged1可促進(jìn)血管增生，增加新生血管數(shù)量，Dll4則抑制無(wú)功能血管的過(guò)度增生，使其功能成熟，二者相互拮抗，并保持動(dòng)態(tài)平衡，共同促進(jìn)血管正常生長(zhǎng)發(fā)育，以保證血液循環(huán)系統(tǒng)的有效建立[3,18]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，Jagged1可作用于Dll4/Notch1信號(hào)通路下游，激活相鄰細(xì)胞Notch3受體，參與平滑肌細(xì)胞分化過(guò)程并調(diào)節(jié)血管成熟；而內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除Jagged1基因可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞分化障礙[19-20]。史少陽(yáng)等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Dll4在視網(wǎng)膜新生血管形成的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可能通過(guò)對(duì)VEGFR的反饋抑制發(fā)揮抑制病理性新生血管過(guò)度形成的作用。而本研究結(jié)果顯示，注藥組患眼纖維血管膜組織Jagged1和Dll4 mRNA及蛋白的表達(dá)量均低于未注藥組，且PDR患眼纖維血管膜組織中Jagged1 mRNA與Dll4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)；Jagged1與Dll4蛋白陽(yáng)性表達(dá)部位大體一致，均主要表達(dá)于血管內(nèi)皮組織，推測(cè)Jagged1與Dll4相互調(diào)節(jié)、相互制約，共同調(diào)節(jié)PDR新生血管的形成。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組黃斑前膜組織中無(wú)新生血管形成，Jagged1和Dll4蛋白及mRNA表達(dá)量也明顯降低，推測(cè)二者在促進(jìn)病理性新生血管的發(fā)生和成熟過(guò)程中發(fā)揮一定作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜中VEGF與Dll4和Notch1表達(dá)量均呈顯著正相關(guān)[22]；結(jié)合本研究中Jagged1與Dll4和Notch1的相關(guān)性，推測(cè)VEGF與Jagged1的表達(dá)同樣呈正相關(guān)。后續(xù)我們將繼續(xù)探索其他相鄰組織中VEGF等相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)一步評(píng)估其與Jagged1表達(dá)的相關(guān)性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Jagged1可能參與PDR病理性新生血管的形成與發(fā)育過(guò)程，并可能與Dll4/Notch1信號(hào)通路相互制約與調(diào)控。本研究入組標(biāo)本較少，免疫組織化學(xué)染色過(guò)程中發(fā)現(xiàn)部分陽(yáng)性表達(dá)蛋白位于血管內(nèi)皮細(xì)胞之外，且在血管新生過(guò)程中，Jagged1與Dll4的表達(dá)并非完全同步。因此，未來(lái)我們將進(jìn)一步行大樣本臨床試驗(yàn)，采用免疫熒光雙標(biāo)法確定細(xì)胞性質(zhì)，并分析不同階段Jagged1與Dll4表達(dá)的相關(guān)性，以更準(zhǔn)確地評(píng)估Jagged1在PDR病變組織中的表達(dá)及作用，為臨床預(yù)防和治療PDR提供新的思路和靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突