胡立影 李志清 邵先鋒 郭小雪 于大為 東莉潔 李筱榮

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點實驗室 300384

非動脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變(non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy，NAION)是臨床上常見的視神經(jīng)病變之一，發(fā)病率僅次于青光眼，可引起患者視野缺損及視力下降，從而影響患者的生活質(zhì)量[1]。NAION早期可表現(xiàn)為視盤充血、水腫，隨著病程進展，出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGC)和軸突丟失，最終導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮[2]。一旦視神經(jīng)萎縮，患者視功能將發(fā)生不可逆改變。然而目前尚缺乏視神經(jīng)萎縮的有效治療方法。因此，若能在視神經(jīng)萎縮發(fā)生前找到相關(guān)治療靶點，將有可能避免視神經(jīng)萎縮的發(fā)生，或減輕視神經(jīng)萎縮的程度。蛋白組是機體產(chǎn)生或修飾的整套蛋白質(zhì)，會隨著機體的狀態(tài)變化而發(fā)生變化[3]。蛋白質(zhì)組學(xué)用于探討生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及變化，可真實反映生理及病理條件下的細胞功能，為疾病各階段的縱向研究、相關(guān)疾病間的橫向比較、疾病發(fā)生的分子標志物及治療靶點的尋找提供重要理論依據(jù)[4]。同位素標記相對和絕對定量(isobaric tag for relative and absolute quantification，iTRAQ)采用高通量篩選技術(shù)，具有良好的精確度及可信度，是一種常用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已逐步應(yīng)用到眼科疾病的研究中，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、青光眼、白內(nèi)障、葡萄膜炎和角膜病變等[5-10]。目前尚缺乏關(guān)于NAION的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究報道。鑒于動物疾病模型在研究疾病發(fā)病機制方面具有重要作用，目前NAION的人類視神經(jīng)檢測標本無法獲取，而且動物模型通?？梢栽谳^短時間內(nèi)建立以模擬人類相關(guān)疾病的病理過程，動物模型的組織標本容易獲得，蛋白組學(xué)在疾病動物模型方面的研究非常多，為人類NAION的發(fā)病機制和治療靶點研究提供了可行的途徑。本研究擬建立大鼠NAION模型，利用iTRAQ標記結(jié)合液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(liquid chromatograph-mass spectrometer and mass spectrometer，LC-MS/MS)對NAION模型大鼠視神經(jīng)整體蛋白進行分析，篩選差異蛋白，為NAION的基礎(chǔ)研究及治療靶點的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康、無眼部疾病的8周齡雄性SPF級SD大鼠14只，購于中國食品藥品檢定研究院，體質(zhì)量200～250 g。所有大鼠均置于同一20～22 ℃鼠舍，正常晝夜節(jié)律，自由飲食、飲水。實驗動物的飼養(yǎng)和使用遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會《實驗動物管理條例》的規(guī)定，本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(批文號：TJYY2021041029)。

1.1.2主要試劑及儀器 孟加拉玫瑰紅(rose Bengal，RB)(美國Sigma公司)；水合氯醛、復(fù)方托吡卡胺滴眼液、熒光素鈉注射液(美國Alcon公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。眼底熒光造影儀(德國海德堡公司)；Infinite M200型酶標儀(瑞士Tecan公司)；532激光機(美國科醫(yī)人公司)；ekspert nanoLC 415液相色譜儀、Triple TOF 6600質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠NAION模型的建立及分組處理 取10只大鼠采用RB聯(lián)合激光光動力方法建立單眼NAION模型[11]。將大鼠腹腔內(nèi)注射質(zhì)量濃度10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)進行麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液點右眼擴瞳后置于532激光機前，按照1 ml/kg劑量經(jīng)鼠尾靜脈注入2.5 mmol/L RB溶液，立即用激光照射視盤上方2/3(激光參數(shù)：波長532 nm，能量50 mW，光斑直徑500 μm，照射時間12 s)；造模后3 d在裂隙燈顯微鏡及眼底前置鏡下觀察模型眼眼底，并行熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA)以進一步確保NAION模型組大鼠視盤水腫形成，具體方法為大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉后置于造影機上，鼠尾靜脈注射0.1 ml熒光素鈉注射液，將造影鏡頭對準視盤，早期為動態(tài)錄像，后期逐個象限拍攝中周部視網(wǎng)膜，5 min后再次拍攝視盤，若FFA圖像上出現(xiàn)視盤熒光素鈉滲漏則認為視盤水腫存在，并排除模型建立過程中造成的其他眼部病變，如眼底出血(1只)和視網(wǎng)膜脫離(1只)。最終造模成功的大鼠共8只，任意選取4只大鼠作為NAION模型組。另取4只體質(zhì)量和周齡相匹配的健康、無眼疾SD大鼠作為正常對照組，不做任何干預(yù)處理。

1.2.2分離大鼠視神經(jīng)及提取組織蛋白 于造模后7 d，分別取NAION模型組及正常對照組大鼠，水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后摘除眼球，沿眼球壁剪下球后視神經(jīng)(長度3～5 mm)于凍存管中，即刻置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱備用。采用胰蛋白酶在37 ℃下消化視神經(jīng)12 h后加入500 μl尿素裂解液在室溫下裂解5 min，冰上超聲(能量為35%)2 min破碎后20 ℃下14 000×g離心10 min，取上清液。BCA法測蛋白濃度，先后經(jīng)還原1 h、烷基化1 h后加入胰蛋白酶，37 ℃孵育12～16 h；4 ℃下14 000×g離心20 min，加入體積分數(shù)1%甲酸終止酶切后制成肽段。

1.2.3組織蛋白質(zhì)譜鑒定及定量分析 取2 μg組織蛋白肽段載入C18的預(yù)柱上，并用不同梯度(6%、9%、12%、15%、18%、21%、25%、30%、35%水相)的洗脫劑(水相：0.1%甲酸、2%乙腈、97.9%水；有機相：98%乙腈、1.9%水、0.1%甲酸)進行洗脫，肽段經(jīng)過C18分析柱分離后進入質(zhì)譜儀中進行一級和二級質(zhì)譜分析。數(shù)據(jù)的采集模式為數(shù)據(jù)依賴性。將質(zhì)譜分析結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Proteinpilot軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索，選用uniprot數(shù)據(jù)庫來鑒定肽段，得到肽段數(shù)和每個蛋白的相對定量值。

1.2.4生物信息學(xué)分析 使用R語言stats包和clusterProfiler包對數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，包括差異蛋白分析、基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。使用STRING數(shù)據(jù)庫對所有差異蛋白進行相互作用分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。NAION模型組與正常對照組間蛋白差異比較采用獨立樣本t檢驗。將差異表達倍數(shù)變化大于1.5倍且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白定義為差異蛋白。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAION模型的建立情況

造模后3 d，正常對照組大鼠視盤邊界清晰(圖1A)，F(xiàn)FA圖像顯示眼底未見明顯熒光素鈉滲漏點(圖1C)。NAION模型組大鼠視盤隆起(圖1B)，F(xiàn)FA圖像顯示視盤區(qū)有熒光素鈉滲漏(圖1D)，提示視盤水腫，模型建立成功。

圖1 各組大鼠造模后3 d眼底及FFA圖像 A：正常對照組眼底圖像 可見視盤邊界清晰 B：NAION模型組眼底圖像 可見視盤水腫 C：正常對照組FFA圖像 眼底未見明顯熒光素鈉滲漏點 D：NAION模型組FFA圖像 可見視盤區(qū)有熒光素鈉滲漏Figure 1 Fundus and FFA images of rats in different groups at 3 days after modeling A:Fundus image of normal rats The boundary of the optic disc was clear B:Fundus image of NAION rats Swollen optic disc was observed C：FFA image of normal rats No fluorescein leakage was found in the optic disc D:FFA image of NAION rats Fluorescein leakage was found in the optic disc

2.2 各組大鼠視神經(jīng)組織蛋白表達變化

與正常對照組比較，NAION模型組共鑒定出差異蛋白80個，其中上調(diào)蛋白5個，下調(diào)蛋白75個。上調(diào)蛋白為V型膠原α1鏈(collagen alpha-1(V) chain，Col5A1)、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基β(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta，Prkacb)、Stomatin樣蛋白2(stomatin-like protein 2，Stoml2)、G蛋白相關(guān)支架蛋白(disks large homolog 1，Dlg1)、跨膜運輸?shù)鞍?0(Transmembrane emp24 domain-containing protein 10，Tmed10)；下調(diào)蛋白中變化明顯的有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶N2(serine/threonine-protein kinase N2，Pkn2)、血小板活化因子乙酰水解酶IB亞基(platelet-activating factor acetylhydrolase IB subunit beta，Pafah1b1)、神經(jīng)微絲蛋白(neurofilament medium polypeptide，Nefm)、細胞周期蛋白依賴性激酶5(mitochondrial tRNA methylthiotransferase CDK5RAP1，Cdk5)、微管相關(guān)蛋白1b(microtubule-associated protein 1B，Map1b)、腺苷酸激酶4(adenylate kinase 4，AK4)、重組人微管關(guān)聯(lián)蛋白Tau(microtubule-associated protein tau，Mapt)和核蛋白TPR等(圖2)。

圖2 各組視神經(jīng)組織差異蛋白分析 A：視神經(jīng)組織差異蛋白聚類分析熱圖 顏色代表標準化蛋白表達量 B：差異蛋白火山圖 2條豎虛線分別代表FC=0.67和FC=1.5時的分界線，橫虛線代表P值為0.05的分界線 FC：差異倍數(shù)Figure 2 Analysis of differentially expressed proteins in the optic nerves between the two groups A:Cluster heat map of differentially expressed proteins Color represented the standard ized protein expressions B:Volcano plot of differentially expressed proteins Two vertical dashed lines represented the dividing lines of FC=0.67 and FC=1.5,respectively,and the horizontal dashed line indicated the dividing line of P=0.05 FC:fold change

2.3 差異蛋白的生物信息學(xué)分析

GO分析結(jié)果顯示，差異蛋白的細胞組分主要富集于細胞外泌體、細胞質(zhì)、細胞核、髓鞘、線粒體、細胞膜、神經(jīng)元投射、突觸及神經(jīng)細胞胞體等(圖3A)；差異蛋白的生物學(xué)進程主要富集在對藥物的反應(yīng)、細胞分裂、細胞運動、細胞對缺氧的反應(yīng)、軸突生成及延伸、突觸調(diào)節(jié)、神經(jīng)元凋亡調(diào)控、軸漿運輸?shù)?圖3B)；差異蛋白的分子功能主要富集于蛋白結(jié)合、蛋白同源二聚化、三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、GTP酶活性、肌球蛋白結(jié)合等(圖3C)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，NAION模型組主要參與代謝通路、抗生素的生物合成、碳代謝作用、突觸囊泡循環(huán)、果糖和甘露糖代謝、血小板活化等信號通路(圖4)。

圖3 NAION模型組與正常對照組視神經(jīng)組織差異蛋白GO富集分析 A：差異蛋白的細胞組分分析 橫軸示差異蛋白數(shù)量；縱軸示細胞組分 B：差異蛋白的生物學(xué)過程分析 橫軸示差異蛋白數(shù)量；縱軸示生物學(xué)過程 C：差異蛋白分子功能分析 橫軸示差異蛋白數(shù)量；縱軸示分子功能Figure 3 GO enrichment analysis of the differentially expressed proteins between the two groups A:Cellular components analysis of differentially expressed proteins The abscissa showed the number of differentially expressed proteins,and the ordinate showed the cellular components B:Biological processes analysis of the differentially expressed proteins The abscissa showed the number of differentially expressed proteins,and the ordinate showed the biological process C:Molecular function analysis of the differentially expressed proteins The abscissa showed the number of differentially expressed proteins,and the ordinate showed the molecular function

圖4 NAION模型組與正常對照組視神經(jīng)組織差異蛋白KEGG通路富集分析Figure 4 KEGG pathway enrichment analysis of the differentially expressed proteins between the two groups

2.4 差異蛋白的蛋白與蛋白相互作用分析

蛋白與蛋白相互作用分析結(jié)果顯示，蛋白-蛋白間具有較多相互作用的有ATP檸檬酸合酶(ATP-citrate synthase，Acly)、DNA拓撲異構(gòu)酶2a(DNA topoisomerase 2-alpha，Top2a)、磷酸核糖胺咪唑羧化酶(multifunctional protein ADE2，Paics)、磷酸三糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase 1，Tpi1)、Ras相關(guān)蛋白(Ras-related protein Ral-A，Rala)、Prkacb、體積調(diào)節(jié)陰離子通道亞基(volume-regulated anion channel subunit LRRC8E，Lrrc8e)、山梨糖醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase，Sord)、Dlg1、Pkn2、Pafah1b1和絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A催化亞基β亞型(serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform，Ppp2cb)等(圖5)。

圖5 蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖 蛋白與蛋白之間關(guān)系越密切，其間連接線段數(shù)量則越多Figure 5 Protein-protein interaction network The closer the relationship between proteins,the more the lines between them

3 討論

NAION是一種常見的視神經(jīng)病變，最終可導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮，目前尚缺乏有效的治療方法。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可用于探討該疾病相關(guān)的致病蛋白并尋找治療靶點。由于NAION患者多為內(nèi)科治療，無法獲得患者的眼內(nèi)液及病理組織進行檢測，又考慮到血液標本對視神經(jīng)組織中蛋白變化的反映有限，且受全身疾病及用藥影響因素較大，故采用實驗動物疾病模型進行研究。嚙齒類動物的視盤血液供應(yīng)方式與靈長類類似[11]，因此本研究采用大鼠NAION模型。Bernstein等[12]成功應(yīng)用光動力學(xué)方法制備SD大鼠AION模型，后期大量研究均證實該模型可模擬臨床AION的病理過程，為AION的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供幫助[13-15]。Slater等[13]研究利用嚙齒動物SD大鼠制備的缺血性視神經(jīng)病變的動物模型發(fā)現(xiàn)，在造模后7～15 d開始逐漸出現(xiàn)RGC凋亡。鑒于此，本研究將取材時間點定于造模后第7天，以便更好地反映NAION急性期蛋白的改變。

本研究結(jié)果顯示，視神經(jīng)組織差異蛋白中包含許多與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能相關(guān)的蛋白，如Nefm和Map1b。Nefm屬于組神經(jīng)絲三聯(lián)體蛋白之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元主要的細胞骨架組成部分，可維持軸突機械強度和穩(wěn)定性，并參與軸突內(nèi)成分間的運輸或定位。多項研究結(jié)果證實，外傷或疾病導(dǎo)致的視神經(jīng)損傷過程中，Nefm表達下調(diào)[16-17]，這與本研究中NAION模型大鼠視神經(jīng)組織Nefm蛋白表達下調(diào)的結(jié)果相一致。Map1b可促進神經(jīng)元微管中的α-微管蛋白酪氨酸化，在伴隨神經(jīng)突延伸的細胞骨架變化中起重要作用。本研究中Map1b在NAION模型大鼠視神經(jīng)組織中表達下調(diào)，與Tzekov等[17]研究發(fā)現(xiàn)外傷性腦損傷誘導(dǎo)視神經(jīng)損傷小鼠模型視神經(jīng)組織Map1b蛋白表達下調(diào)的結(jié)果一致。但Dieterich等[18]研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)組織中Map1b表達水平在視神經(jīng)擠壓后2周內(nèi)升高。該差異可能與軸突破裂和變性的不同時期有關(guān)，具體機制需進一步研究。我們推測，在NAION發(fā)生時，Nefm和Map1b可能通過改變細胞骨架的穩(wěn)定性來影響軸突的功能。

Rho激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，Rho/Rho激酶信號通路普遍存在于各組織細胞中，可參與多種生物學(xué)功能。Rho/Rho激酶信號通路可調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架狀態(tài)并參與調(diào)控細胞增生與凋亡等；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Rho/Rho激酶信號通路可被缺血、缺氧等因素異常激活，發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞遷移、增生及影響軸突再生的作用，與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如癲癇、阿爾茨海默病及腦卒中等[19-21]。本研究結(jié)果顯示，NAION模型視神經(jīng)組織中Rala、Pafah1b1、Pkn2和RhoA等與Rho的功能密切相關(guān)的蛋白表達下調(diào)。Rala屬于Ras小G蛋白家族，可參與細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運、增生、遷移和凋亡等多種生物學(xué)功能[22]。Ral/Rho通路與神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)。研究表明，Rala在胚胎期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達，在眼部視網(wǎng)膜上亦有表達變化，在視網(wǎng)膜色素變性中可調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡[23-24]。Rala還可影響胚胎神經(jīng)元的神經(jīng)突的分化及極性，對神經(jīng)母細胞的遷移具有調(diào)節(jié)作用[25-26]。此外，Rala也可通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位影響ATP的生成，從而影響細胞能量代謝[27]。因此，我們推測在NAION中，Rala可能通過改變線粒體膜電位來影響神經(jīng)細胞代謝。Pafah1b1是大腦皮層正常發(fā)育所必需的，也是首個被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元遷移異常相關(guān)的基因[28-29]。Pafah1b1可激活Rho激酶和肌動蛋白，通過調(diào)節(jié)細胞骨架動力學(xué)來控制神經(jīng)元遷移[30]。Pafah1b1活性降低的小鼠可表現(xiàn)出嚴重的大腦混亂以及小腦缺陷[30]。Pafah1b1基因突變是輕度腦干鈣化和基底節(jié)鈣化的原因[31]。Pkn2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在調(diào)節(jié)細胞周期進程、肌動蛋白細胞骨架裝配、細胞遷移、細胞黏附、腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)錄激活等信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用[32]，既往研究表明，Pkn2可被Rho激酶激活，調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白，從而發(fā)揮促進突觸生長的作用[33-34]。因此，我們推測當(dāng)NAION發(fā)生時，Pafah1b1可通過影響Rho/Rho激酶信號通路，進而引起Pkn2的表達異常，導(dǎo)致神經(jīng)元遷移和細胞周期異常、細胞骨架改變，最終導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮。

本研究結(jié)果還顯示，NAION模型視神經(jīng)組織中Prkacb和Col5a蛋白表達上調(diào)。Prkacb為蛋白激酶cAMP激活的催化亞基β，可介導(dǎo)cAMP依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。cAMP依賴蛋白激酶PKA的激活可調(diào)節(jié)多種細胞過程，例如細胞增生、細胞周期、微管動力學(xué)的分化和調(diào)節(jié)、染色質(zhì)凝結(jié)和解凝、核被膜拆解和重組以及細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制和離子通量的調(diào)節(jié)。cAMP/PKA通路與RGC的存活和軸突生長發(fā)育密切相關(guān)[35-36]。有研究表明，視神經(jīng)損傷后，蜥蜴RGC中cAMP水平升高，cAMP/PKA信號通路的激活在蜥蜴視網(wǎng)膜軸突再生中起關(guān)鍵作用[37]。而大鼠視神經(jīng)損傷后也可通過激活PKA途徑提高RGC的存活率[38]。青光眼的動物模型中，cAMP/PKA通路的激活可減輕神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生，降低促炎介質(zhì)的表達水平，并增強青光眼中的神經(jīng)元活力[39]。因此，我們推測在NAION發(fā)生過程中，Prkacb可通過激活cAMP通路發(fā)揮重要作用，其可能成為未來治療靶點之一。膠原蛋白V是一種形成原纖維的膠原蛋白，普遍存在于人體中，與膠原纖維生成有關(guān)，其表達異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在青光眼患者的視神經(jīng)組織中，Col5A1表達明顯上調(diào)，它可能是通過細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)受體的交叉反應(yīng)及局部黏連繼而引起ECM重塑等通路導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮[40-42]。此外，Col5A1基因與腕管綜合證的發(fā)病相關(guān)[43]。在NAION中，Col5A1可能與膠質(zhì)細胞增生密切相關(guān)，其機制仍有待進一步研究。

蛋白與蛋白相互作用分析結(jié)果表明，Acly、Paics及Tpi1與其他蛋白之間的聯(lián)系密切，這幾個蛋白均與能量的合成有關(guān)，推測這些蛋白表達水平的下調(diào)可能是由于在NAION大鼠中RGC能量合成受到抑制，出現(xiàn)能量代謝障礙，從而影響軸突再生并促進RGC細胞的凋亡。

本研究尚存在一些不足，如未能直接對臨床病理標本進行蛋白組學(xué)分析；NAION動物模型不能完全模擬NAION患者疾病發(fā)病過程；未設(shè)置單純RB注射組及單純激光照射組，故無法完全排除這些因素導(dǎo)致的視神經(jīng)組織蛋白變化；一種蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)并不能完全檢測出組織中全部蛋白，且檢測出的蛋白需要與數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定，此過程有可能產(chǎn)生誤差；此外，本研究未能對差異蛋白進行功能驗證。未來我們將采用實時熒光定量PCR及Western blot等手段對差異蛋白進行驗證，并將分組細化至NAION模型組、單純RB注射組、單純激光照射組及正常對照組，從而確保差異蛋白的準確性，并對差異蛋白進一步進行功能及機制研究。由于本研究是基于動物模型的蛋白組學(xué)研究，其結(jié)果與人類疾病的關(guān)聯(lián)性還有待進一步驗證，但該研究結(jié)果可為人類疾病研究提供一定的實驗依據(jù)。

綜上所述，本研究利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對NAION大鼠模型中視神經(jīng)組織差異蛋白進行定量檢測，共檢測差異蛋白80個，這些差異蛋白主要與神經(jīng)生長、能量代謝、軸漿運輸及凋亡等信號通路相關(guān)，本研究結(jié)果為尋找NAION相關(guān)治療靶點提供了實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突