李宏松 李蓉 王麗君 廖丁瑩 王建明

1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科710004；2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科 710077

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的眼部并發(fā)癥之一，是一種與持續(xù)性高血糖相關(guān)的慢性、進(jìn)行性、可致盲的視網(wǎng)膜微血管病變[1]。研究表明，高血糖、氧化應(yīng)激和慢性炎癥是DR發(fā)生的重要機(jī)制[2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含Pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(nucleotide-binding domain,leucine-rich-containing family,pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎癥小體是固有免疫的重要組分，是參與多種炎癥相關(guān)疾病的關(guān)鍵因子，其能被活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)激活，并調(diào)控下游的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等病理生理過程[3]。有研究顯示，DR患者玻璃體腔纖維增生膜中NLRP3高表達(dá)[4]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞是DR增生膜的重要細(xì)胞來源，位于神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間，組成血-視網(wǎng)膜屏障，從而維持視網(wǎng)膜正常功能，而且RPE細(xì)胞具有清除自由基、分泌色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等活性物質(zhì)的功能[5]。RPE細(xì)胞功能異常會(huì)導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障的破壞以及PEDF和VEGF分泌失衡，最終引起新生血管的產(chǎn)生，而且RPE細(xì)胞間緊密連接的破壞會(huì)引起細(xì)胞遷移和增生，最終參與增生膜的形成[6]。因此，RPE細(xì)胞在DR發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。目前，NLRP3炎癥小體在高糖誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究擬探討NLRP3炎癥小體途徑在高糖損傷RPE細(xì)胞中的作用及機(jī)制，以期為DR的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 人RPE細(xì)胞株ARPE-19購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；兔抗凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白單克隆抗體(apoptosis associated speck-like protein containing CARD，ASC)(ab155970)、兔抗Caspase-1單克隆抗體(ab207802)(英國(guó)Abcam公司)；兔抗NLRP3多克隆抗體(NBP2-12446)(美國(guó)Novus Biologicals公司)；兔抗凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)多克隆抗體(3869)、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)多克隆抗體(2772)、兔抗Caspase-3多克隆抗體(9662)(美國(guó)CST公司)；兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體(AB-P-R 001)(杭州賢至生物有限公司)；NLRP3抑制劑CY-09(美國(guó)Selleck公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit，CCK-8)(美國(guó)MedChemExpress公司)；APC/7-AAD細(xì)胞凋亡試劑盒(天津三箭生物技術(shù)股份有限公司)；活性氧檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠);室溫低速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；低溫高速離心機(jī)(上海力康生物醫(yī)療科技公司)。

1.2 方法

1.2.1高糖誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷模型建立 取ARPE-19細(xì)胞株，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞分為正常對(duì)照組和高糖組，分別置于正常培養(yǎng)液和含終濃度30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h。

1.2.2熒光探針及生物化學(xué)檢驗(yàn)法檢測(cè)正常對(duì)照組和高糖組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo) (1)DCFH-DA熒光探針檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS含量 取各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，質(zhì)量濃度0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；用無血清培養(yǎng)液按照1∶ 1 000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，用稀釋好的DCFH-DA重懸細(xì)胞，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。(2)生物化學(xué)檢驗(yàn)法檢測(cè)各細(xì)胞中SOD活力值和MDA濃度 將細(xì)胞以2×105個(gè)/ml密度接種于6孔板中，收集各組細(xì)胞放入EP管中，加入200 μl雙蒸水，直接放入液氮3～5 s，立即取出并轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱中放置20～30 s，取出于室溫下解凍約5 min(EP管內(nèi)冰融化即可)，上述操作重復(fù)3次，形成勻漿液；將勻漿液于5 000 r/min離心5～10 min，取上清液待用。分別根據(jù)SOD和MDA生化試劑盒說明書對(duì)上清液進(jìn)行SOD活力值和MDA濃度檢測(cè)。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)不同濃度CY-09作用后細(xì)胞增生率 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成5×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，按照每孔100 μl單細(xì)胞懸液均勻接種至96孔板中，同時(shí)設(shè)置空白孔作為對(duì)照，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)過夜。按照1.2.1部分進(jìn)行分組處理，并取正常對(duì)照組和高糖組細(xì)胞分別加入0、2、5、10、15和20 μmol/L CY-09培養(yǎng)48 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37 ℃培養(yǎng)4 h，振蕩10 min，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度(A)值。計(jì)算各組不同濃度CY-09處理后細(xì)胞增生率，細(xì)胞增生率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白孔A值)/(正常對(duì)照組A值-空白孔A值)×100%。根據(jù)細(xì)胞增生率選擇CY-09作用的適宜濃度。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞以2×105個(gè)/ml密度接種于6孔板中，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、正常+CY-09組、高糖組和高糖+CY-09組，其中正常+CY-09組和高糖+CY-09組培養(yǎng)液中添加15 μmol/L CY-09;培養(yǎng)48 h，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。按照Annexin-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，加入500 μl上樣緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μl 7-AAD和Annexin-APC染色，室溫下避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5Western blot法檢測(cè)細(xì)胞炎癥小體相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 按照1.2.4部分收集各組細(xì)胞，加入400 μl RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣40 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；取膜于含有50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液內(nèi)室溫封閉2 h，加入GAPDH、NLRP3、ASC、Caspase-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗(均1∶ 1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，含體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫20的TBS緩沖液(TBST)洗膜；用TBST稀釋HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶ 50 000)室溫下?lián)u床上孵育2 h。超敏ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光后掃描膠片，并采用ImageJ軟件進(jìn)行圖像處理與分析。以GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白與GAPDH的蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Graphpad Prism 8.0軟件繪制圖表。計(jì)量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。采用均衡分組單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計(jì)，正常對(duì)照組與高糖組間各計(jì)量資料差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間計(jì)量資料總體差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組與高糖組RPE細(xì)胞內(nèi)ROS含量、MDA濃度和SOD活力值的比較

高糖組RPE細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度值為120 020±3 245，明顯高于正常對(duì)照組的35 426±811，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.760，P<0.05)。高糖組RPE細(xì)胞內(nèi)MDA濃度為(4.92±0.09)nmol/mg，明顯高于正常對(duì)照組的(1.78±0.03)nmol/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=46.960，P<0.05)；高糖組SOD活力值為(35.65±1.22)μmol/(min·mg)，明顯低于正常對(duì)照組的(74.96±1.41)μmol/(min·mg)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.830，P<0.05)(圖1)。

圖1 正常對(duì)照組與高糖組RPE細(xì)胞內(nèi)ROS含量、MDA濃度、SOD活力值比較 A：各組ROS熒光強(qiáng)度值比較 B:各組MDA濃度比較 C:各組SOD活力值定量比較 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) ROS：活性氧簇；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物岐化酶Figure 1 Comparison of ROS content,MDA concentration and SOD activity in RPE cells between the two groups A:Comparison of ROS fluorescence intensity B:Comparison of MDA concentration C:Comparison of SOD activity Compared with the normal control group,aP<0.05 (Independent samples t-test,n=3) ROS:reactive oxygen species;MDA:malondialdehyde;SOD:superoxide dismutase

2.2 各組內(nèi)不同濃度CY-09處理細(xì)胞的增生率比較

倒置顯微鏡下可見，正常對(duì)照組RPE細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)多呈較為飽滿的多邊形及梭形、細(xì)胞質(zhì)豐富，相鄰細(xì)胞呈聚集狀態(tài)；高糖組RPE細(xì)胞呈散在分布，細(xì)胞活力及細(xì)胞密度均較正常對(duì)照組降低(圖2)。高糖組細(xì)胞增生率明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.820，P<0.05)。正常對(duì)照組中不同濃度CY-09處理細(xì)胞的增生率總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.729，P=0.003)，其中2、5、10和15 μmol/L CY-09處理細(xì)胞的增生率與0 μmol/L CY-09處理細(xì)胞比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；20 μmol/L CY-09處理細(xì)胞的增生率明顯低于0 μmol/L CY-09處理細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高糖組中不同質(zhì)量濃度CY-09處理細(xì)胞的增生率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.490，P<0.001)，其中2 μmol/L和5 μmol/L CY-09處理細(xì)胞的增生率與0 μmol/L CY-09處理細(xì)胞比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；10、15和20 μmol/L CY-09處理細(xì)胞的增生率明顯高于0 μmol/L CY-09，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。15 μmol/L CY-09處理細(xì)胞的增生值達(dá)到高糖組峰值且該濃度對(duì)正常細(xì)胞增生率無明顯影響。因此，確定15 μmol/L CY-09為實(shí)驗(yàn)組后續(xù)干預(yù)濃度。

圖2 正常對(duì)照組和高糖組培養(yǎng)后48 h RPE細(xì)胞形態(tài)(×100，標(biāo)尺=100 μm) A：正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)多呈較為飽滿的多邊形，相鄰細(xì)胞呈聚集狀態(tài) B：高糖組細(xì)胞呈低密度散在分布Figure 2 Morphology of RPE cells after 48-hour culture in the two groups (×100，bar=100 μm) A:Cells were full polygons in shape and gathered in clusters in the normal control group B:Cells were scatteredly distributed with low density in the high-glucose group

表1 正常對(duì)照組和高糖組不同濃度CY-09處理細(xì)胞增生率比較(mean±SD,%)Table 1 Comparison of proliferation rate of cells among different concentrations of CY-09 treatment in the two groups (mean±SD,%)不同濃度CY-09樣本量正常對(duì)照組細(xì)胞增生率高糖組細(xì)胞增生率0 μmol/L3100.00±1.9866.50±1.562 μmol/L3100.28±2.3967.78±1.735 μmol/L399.86±1.5570.78±0.5310 μmol/L399.33±2.6379.51±2.53a15 μmol/L395.14±2.6587.90±2.08a20 μmol/L390.43±1.43a79.36±2.17aF值6.72939.490P值0.003 <0.001 注:與各自組內(nèi)0 μmol/L CY-09處理比較,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Note:Compared with the respective 0 μmol/L CY-09 treatment,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

2.3 各組細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)比較

正常對(duì)照組、正常+CY-09組、高糖組和高糖+CY-09組NLRP3、ASC、活化Caspase-1(cleaved-Caspase-1，相對(duì)分子質(zhì)量為20 000)蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=158.700、172.100、135.100，均P<0.05)。Caspase-1前體(pro-Caspase-1，相對(duì)分子質(zhì)量為45 000)相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.195，P=0.897)。正常+CY-09組NLRP3和ASC蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，高糖組NLRP3、ASC和cleaved-Caspase-1相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組和高糖+CY-09組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖3，表2)。

表2 各組細(xì)胞中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative expression levels of NLRP3,ASC and Caspase-1 among various groups (mean±SD)組別樣本量NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量ASC蛋白相對(duì)表達(dá)量pro-Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量cleaved-Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組30.186±0.0300.207±0.0040.419±0.0380.048±0.003正常+CY-09組30.078±0.003a0.112±0.007 a0.417±0.0440.025±0.009 a高糖組30.398±0.002 a0.489±0.034 a0.399±0.0300.156±0.010 a高糖+CY-09組30.277±0.004b0.339±0.003 b0.421±0.0070.089±0.002bF值158.700172.1000.195135.100P值<0.01<0.010.897<0.01 注:與各自正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與各自高糖組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) NLRP3:核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)合域樣受體家族含Pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3;ASC:凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 Note:Compared with the respective normal control group,aP<0.05;compared with the respective high-glucose group,bP<0.05 (One-way ANO-VA,LSD-t test) NLRP3:nucleotide-binding domain,leucine-rich-containing family,pyrin domain-containing 3;ASC:apoptosis associated speck-like protein containing CARD

圖3 各組RPE細(xì)胞內(nèi)炎癥小體NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)電泳圖 正常+CY-09組NLRP3、ASC和cleaved-Caspase-1蛋白條帶灰度弱于正常對(duì)照組，高糖組NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1蛋白條帶灰度強(qiáng)于正常對(duì)照組和高糖+CY-09組；pro-Caspase-1蛋白條帶灰度在各組間無明顯差異 1：正常對(duì)照組；2：正常+CY-09組；3：高糖組；4：高糖+CY-09組 NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含Pryrin結(jié)構(gòu)域蛋白3；ASC：凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶Figure 3 Electrophoretogram of NLRP3,ASC and Caspase-1 in different groups detected by Western blot Compared with the normal control group,the intensity of NLRP3,ASC and cleaved-Caspase-1 bands was decreased in normal+CY-09 group.Compared with the high-glucose group,the intensity of NLRP3,ASC and cleaved-Caspase-1 bands was decreased in the normol control group and the high-glucose+CY-09 group.The intensity of pro-Caspase-1 bands was not significantly different among various groups 1:normal control group;2:normal+CY-09 group;3:high-glucose group;4:high-glucose+CY-09 group NLRP3:nucleotide-binding domain,leucine-rich-containing family,pyrin domain-containing 3;ASC:apoptosis associated speck-like protein containing CARD;GAPDH:glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較

正常對(duì)照組、正常+CY-09組、高糖組、高糖+CY-09組細(xì)胞凋亡率分別為(6.67±1.05)%、(5.12±0.19)%、(21.68±0.41)%和(13.96±0.07)%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=346.300，P<0.05)，其中高糖組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組和高糖+CY-09組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；正常+CY-09組細(xì)胞凋亡率略低于正常對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖4 各組細(xì)胞凋亡情況 A：各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞檢測(cè)圖 B：各組細(xì)胞凋亡率比較 F=346.300,P<0.05. 與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) 1：正常對(duì)照組；2：正常+CY-09組；3：高糖組；4：高糖+CY-09組Figure 4 Apoptosis of the RPE cells in various groups A:Flow cytometry results of various groups B:Comparison of the apoptosis rate among various groups F=346.300,P<0.05. Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the high-glucose group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:normal control group;2:normal+CY-09 group;3:high-glucose group;4:high-glucose+CY-09 group

2.5 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達(dá)比較

正常對(duì)照組、正常+CY-09組、高糖組和高糖+CY-09組間細(xì)胞cleaved-Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.930、239.200、332.200，均P<0.01)，各組間pro-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.525，P=0.677)。正常+CY-09組Bax及cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；高糖組Bax及cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組和高糖組+CY-09組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組和高糖組+CY-09組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5，表3)。

表3 各組細(xì)胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 3 Comparison of the relative expression levels of Caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins among various groups (mean±SD)組別樣本量pro-Caspase-3相對(duì)表達(dá)量cleaved-Caspase-3相對(duì)表達(dá)量Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組30.604±0.0250.083±0.0050.301±0.0280.100±0.001正常+CY-09組30.617±0.0130.051±0.006a0.123±0.006 a0.244±0.006 a高糖組30.613±0.0120.190±0.011a0.685±0.022 a0.050±0.004 a高糖+CY-09組30.598±0.0100.137±0.011b0.572±0.029 b0.174±0.010 bF值0.52585.930239.200332.200P值0.677<0.01<0.01<0.01 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與高糖組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Bax:Bcl相關(guān)X蛋白;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤因子-2 Note:Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the high-glucose group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) Bax:Bcl-2 associated X protein;Bcl-2:B cell lym-phoma factor-2

圖5 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)電泳圖 正常+CY-09組cleaved-Caspase-3和Bax蛋白條帶灰度弱于正常對(duì)照組，Bcl-2蛋白條帶灰度強(qiáng)于正常對(duì)照組；高糖組cleaved-Caspase-3和Bax蛋白條帶灰度強(qiáng)于正常對(duì)照組和高糖組+CY-09組，Bcl-2蛋白條帶灰度弱于正常對(duì)照組和高糖組+CY-09組；pro-Caspase-3蛋白條帶灰度在各組間無明顯差異 1：正常對(duì)照組；2：正常+CY-09組；3：高糖組；4：高糖+CY-09組 Bax：Bcl相關(guān)X蛋白；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶Figure 5 Electrophoretogram of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in different groups detected by Western blot Compared with the normal control group,the intensity of cleaved-Caspase-3 and Bax bands was decreased and the intensity of Bcl-2 band was increased in normal+CY-09 group.Compared with the high-glucose group,the intensity of cleaved-Caspase-3 and Bax bands was decreased and the intensity of Bcl-2 band was increased in the normal control group and the high-glucose+CY-09 group;the intensity of pro-Caspase-3 bands was not significantly different among various groups 1:normal control group;2:normal+CY-09 group;3:high-glucose group;4:high-glucose+CY-09 group Bax:Bcl-2 associated X protein;Bcl-2:B cell lymphoma-2;GAPDH:glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

3 討論

高糖環(huán)境可激活RPE細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量ROS，造成細(xì)胞毒性損傷，或直接通過損傷線粒體造成RPE細(xì)胞凋亡[7-8]。RPE細(xì)胞凋亡可影響ROS的清除及PEDF等活性因子的分泌，有可能促進(jìn)DR的發(fā)生和發(fā)展。本研究采用高糖誘導(dǎo)RPE細(xì)胞氧化損傷模型，也發(fā)現(xiàn)高糖條件下RPE細(xì)胞中ROS含量和脂質(zhì)過氧化物MDA濃度均升高，SOD活力值降低，細(xì)胞的增生受到明顯抑制，證實(shí)了高糖能誘導(dǎo)RPE細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞增生。本研究結(jié)果還顯示，高糖組中10、15和20 μmol/L CY-09處理細(xì)胞的增生率明顯高于0 μmol/L CY-09處理細(xì)胞，推測(cè)NLRP3參與高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞增生調(diào)控。

高糖環(huán)境下線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞內(nèi)NLRP3介導(dǎo)的信號(hào)通路激活[9]。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、接頭蛋白ASC和蛋白酶pro-Caspase-1組成的多蛋白復(fù)合物。Pro-Caspase-1被激活后自剪切形成的cleaved-Caspase-1介導(dǎo)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18等促炎因子的分泌[10-11]；NLRP3炎癥小體也可以通過激活Caspase-3引起細(xì)胞凋亡[12]。Wang等[13]在增生性玻璃體疾病患者的玻璃體液中發(fā)現(xiàn)NLPR3、ASC、Caspase-1及其他炎癥因子顯著高表達(dá)，而且NLRP3炎癥小體可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)極其復(fù)雜的生命活動(dòng)過程，涉及多種凋亡通路。Bcl-2蛋白通過阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放來抑制細(xì)胞凋亡，Bax通過與線粒體上的膜通道結(jié)合促使細(xì)胞色素C釋放而促進(jìn)凋亡[14]。Caspase-3在細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑中位于核心位置，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[15-16]。王衛(wèi)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞中NLRP3表達(dá)水平可以抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖組RPE細(xì)胞凋亡率、炎癥小體相關(guān)蛋白、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降；正常+CY-09組與正常對(duì)照組相比，高糖+CY-09組與高糖組相比，RPE細(xì)胞凋亡率下降，NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、Bax和cleaved-Caspase-3表達(dá)均降低，Bcl-2的表達(dá)則上調(diào)。以上結(jié)果充分顯示高糖環(huán)境可激活炎癥小體NLRP3，引起RPE細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究證實(shí)高糖環(huán)境可提高RPE細(xì)胞內(nèi)ROS含量和MDA濃度，抑制RPE細(xì)胞增生并促進(jìn)其凋亡；NLRP3抑制劑可提高高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞的增生率并抑制其凋亡，推測(cè)NLRP3炎癥小體參與了高糖條件下RPE細(xì)胞的凋亡過程。然而，本研究尚未明確NLRP3炎癥小體通路與細(xì)胞凋亡之間的直接關(guān)系；未進(jìn)行IL等下游分子的檢測(cè)；僅為體外細(xì)胞學(xué)研究，尚需進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究。我們需進(jìn)一步探討NLRP3炎癥小體與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為預(yù)防和治療DR提供潛在的靶向目標(biāo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突