劉曦 孫曉萍 楊建偉 朱冬梅 王媛

鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院眼科 450000

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)是視網(wǎng)膜最早分化的神經(jīng)細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)和加工視覺(jué)信號(hào)的功能。長(zhǎng)期慢性高血糖可引起RGCs凋亡和功能障礙，導(dǎo)致視網(wǎng)膜形態(tài)和功能發(fā)生異常，進(jìn)而造成糖尿病患者視力喪失[1]。現(xiàn)有的臨床治療方法存在固有的局限性，難以完全治愈糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopahy，DR)。尋找更安全有效的治療方法是目前DR研究關(guān)注的熱點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類(lèi)具有自我更新能力和多項(xiàng)分化潛能的干細(xì)胞，為神經(jīng)再生提供有利條件，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生和功能恢復(fù)[2]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUC-MSC)是從人臍帶獲取的一類(lèi)MSCs，來(lái)源廣泛、取材方便、免疫原性低，可修復(fù)多種原因引起的器官損傷，其在心肌梗死、卵巢早衰等多種疾病的治療中被廣泛應(yīng)用[3-4]。已有研究證實(shí)，通過(guò)移植hUC-MSC對(duì)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)損傷具有一定修復(fù)作用[5]。但hUC-MSC對(duì)RGCs凋亡作用機(jī)制的研究尚缺乏。本研究擬觀(guān)察hUC-MSC玻璃體內(nèi)注射對(duì)DR模型大鼠RGCs凋亡的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡SD雄性大鼠[SCXK(京)2016-0011，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司]65只，體質(zhì)量(230±20)g。大鼠于溫度(20±2)℃、相對(duì)濕度(50±10)%、12 h/12 h光暗交替的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前全部用裂隙燈顯微鏡進(jìn)行眼底檢查，排除眼部疾病。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用遵循美國(guó)視覺(jué)和眼科研究協(xié)會(huì)聲明。本研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：20180316)。

1.1.2主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國(guó)Sigma公司)；hUC-MSC(1×106個(gè)/管，廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司)；異硫氰酸熒光素葡聚糖(瑞典TdB Labs AB公司)；高糖高脂飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司)；熒光金(fluoro gold，F(xiàn)G)(美國(guó)Biotium公司)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)；免疫組化試劑盒(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗大鼠B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma /leukemia-2，Bcl-2)單克隆抗體(ab182858)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)單克隆抗體(ab32503)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)單克隆抗體(ab32142)、磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38MAPK)多克隆抗體(ab47363)、β-actin(ab8227)、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記、山羊抗兔IgG(ab6721)(英國(guó)Abcam公司)。裂隙燈顯微鏡(YZ5S)、檢眼鏡(YZ-6E)(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司)；腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；TOPCON50DX型血管熒光造影機(jī)(日本TOPCON公司)；DMi8倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；PowerPac系列電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1DR模型的制備及分組 STZ以pH4.5的檸檬酸緩沖液稀釋?zhuān)S機(jī)選取45只大鼠，按照60 mg/kg單次腹腔注射STZ，誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。STZ注射后72 h，尾靜脈采血測(cè)量大鼠血糖，連續(xù)測(cè)量3 d，3次血糖均≥16.7 mmol/L，視為成功建立糖尿病大鼠模型。45只大鼠均成功建立糖尿病模型，繼續(xù)飼喂高糖高脂飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司)4周，期間每周測(cè)一次空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和體質(zhì)量，使其血糖維持在16.7 mmol/L以上，剔除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡及白內(nèi)障大鼠5只，剩余40只大鼠。末次飼喂高糖高脂飼料后，將50 mg/ml異硫氰酸葡聚糖溶解于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)中后經(jīng)尾靜脈注入，采用眼底血管熒光造影機(jī)行眼底血管熒光造影檢查，眼底出現(xiàn)微血管瘤或者微血管病變的大鼠視為DR造模成功。DR模型大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組20只，hUC-MSC注射組20只。另選取20只正常大鼠為對(duì)照組，腹腔注射等量檸檬酸緩沖液，飼喂正常飼料。

1.2.2hUC-MSC玻璃體內(nèi)注射 DR造模成功后，采用復(fù)方托吡卡胺滴眼液[參天制藥(中國(guó))有限公司]充分?jǐn)U瞳后進(jìn)行干預(yù)。hUC-MSC注射組大鼠玻璃體內(nèi)注射hUC-MSC，注射劑量參照文獻(xiàn)[6]，使用微量注射器抽取1 μl hUC-MSC(1×106個(gè))，打散細(xì)胞，注射器于角鞏膜緣后1 mm約40°斜角進(jìn)針，繞過(guò)晶狀體到達(dá)視網(wǎng)膜中央，透過(guò)角膜和晶狀體看到針尖出現(xiàn)進(jìn)行注射，避免損傷晶狀體，注射完畢后停留30 s后拔針。對(duì)照組和模型組大鼠注射等量PBS。注射完畢后用紅霉素眼膏(上海通用藥業(yè)股份有限公司)點(diǎn)眼以預(yù)防炎癥。各組均注射2次，2次注射間隔7 d。

1.2.3FG逆行示蹤標(biāo)記RGCs觀(guān)察存活RGCs數(shù)目 末次玻璃體內(nèi)注射后7 d，每組采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后固定于腦立體定位儀上，顱頂備皮，分離頭皮筋膜組織暴露顱骨前囟骨性標(biāo)志，確定Bregme點(diǎn)，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定雙側(cè)上丘及外側(cè)膝狀體，用牙科鉆鉆約1 mm直徑骨孔，用10 μl微量注射器向4個(gè)骨孔注射體積分?jǐn)?shù)2%的FG各2 μl，注射完畢后，留針5 min再緩慢拔出針頭，縫合筋膜和皮膚。標(biāo)記后4 d，腹腔注射麻醉大鼠，開(kāi)胸，左心室插管用生理鹽水進(jìn)行灌注，改用質(zhì)量濃度4%多聚甲醛固定，待四肢及尾部出現(xiàn)顫動(dòng)、逐漸僵硬，肝臟顏色變白時(shí)停止灌注。摘取左側(cè)眼球，剪除角膜、晶狀體和玻璃體，分離視網(wǎng)膜，鋪于載玻片上，選取視網(wǎng)膜周邊4處剪開(kāi)并鋪平，50%甘油封片，熒光顯微鏡下拍照，采用Image Pro-Plus軟件計(jì)數(shù)RGCs，以每mm2中的RGCs數(shù)量作為細(xì)胞密度。

1.2.4蘇木精-伊紅染色觀(guān)察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化 末次玻璃體內(nèi)注射后7 d，每組采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取10只大鼠過(guò)量麻醉法處死，摘取左側(cè)眼球，于4%多聚甲醛中固定24 h；去除眼前節(jié)和玻璃體，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度4 μm，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察視網(wǎng)膜形態(tài)變化。

1.2.5TUNEL染色觀(guān)察RGCs凋亡情況 取石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，體積分?jǐn)?shù)30% H2O2室溫處理10 min，PBS沖洗；蛋白酶K 37 ℃消化10 min，PBS沖洗；加入標(biāo)記液于37 ℃濕盒內(nèi)孵育2 h，滴加封閉液室溫封閉30 min，加入生物素化抗地高辛抗體于37 ℃濕盒孵育30 min，PBS沖洗；加入鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(streptavidin-biotin complex，SABC)于37 ℃濕盒孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色5 min，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察RGC層細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜Bax、Bcl-2、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)水平 末次玻璃體內(nèi)注射后7 d，摘取各組剩余5只大鼠左側(cè)眼球，保存于液氮中。取液氮中保存的眼球，剝離視網(wǎng)膜，加入RIPA液裂解組織，冰上孵育30 min，12 000×g4 ℃條件下離心10 min,取上清，BCA法蛋白定量。取加樣緩沖液加入蛋白樣品中，煮沸10 min使蛋白變性，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，置于質(zhì)量濃度5%脫脂奶粉中封閉2 h；TBST溶液洗膜，加入1∶ 2 000稀釋的Bax、Bcl-2、p38MAPK、p-p38MAPK或β-actin一抗，4 ℃條件下孵育過(guò)夜；TBST溶液洗膜，加入1∶ 5 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗，室溫下孵育2 h；TBST溶液洗膜，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，曝光顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度比值，作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中計(jì)量資料經(jīng)W檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示，各組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模過(guò)程中FBG和體質(zhì)量變化情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組大鼠FBG維持在正常水平，體質(zhì)量隨時(shí)間逐步增長(zhǎng)；造模組大鼠FBG維持在較高水平，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，并于造模第2周開(kāi)始，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)(圖1)。

圖1 造模組和對(duì)照組大鼠FBG和體質(zhì)量隨時(shí)間變化情況 A：各組大鼠不同時(shí)間FBG變化曲線(xiàn) 對(duì)照組大鼠FBG維持在正常水平；造模組大鼠FBG維持在高水平 B：各組大鼠不同時(shí)間體質(zhì)量變化曲線(xiàn) 對(duì)照組大鼠體質(zhì)量隨時(shí)間平穩(wěn)增長(zhǎng)；造模組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，并于造模第2周開(kāi)始逐步下降 FBG：空腹血糖Figure 1 Changes of FBG and body weight of rats in each group A:Change curves of FBG The FBG of rats in the control group was maintained at a normal level,and the FBG of rats in the modeling group was maintained at a high level B：Change curves of body weight The body weight of rats in the control group was increased steadily over time,and the body weight of rats in the modeling group was increased slowly,and began to gradually decrease on the second week after modeling FBG:fasting blood glucose

2.2 造模后視網(wǎng)膜血管走行和滲漏情況

對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜血管呈放射狀排列，分布規(guī)則，血管走行正常，無(wú)熒光素滲漏；造模組大鼠視網(wǎng)膜遠(yuǎn)端血管發(fā)生扭曲，形狀不規(guī)則，可見(jiàn)毛細(xì)血管熒光素滲漏，滲漏面積較大(圖2)。

圖2 各組大鼠眼底血管熒光造影圖 A：對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜血管走行正常，無(wú)熒光素滲漏 B：造模組大鼠視網(wǎng)膜遠(yuǎn)端血管發(fā)生扭曲，可見(jiàn)大面積熒光素滲漏Figure 2 Fundus angiography images of the two groups A:The retinal blood vessels of rats in the control group run normally without fluorescein leakage B：The distal retinal vessels of rats in the modeling group were distorted and large area of fluorescein leakage was observed

2.3 各組大鼠RGCs存活情況變化

對(duì)照組、模型組和hUC-MSC注射組FG逆行示蹤標(biāo)記RGCs密度分別為(2 136.10±215.17)、(849.40±167.82)和(1 549.20±183.26)個(gè)/mm2，各組RGCs密度總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=115.218，P<0.01)；其中模型組和hUC-MSC注射組RGCs密度較對(duì)照組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；hUC-MSC注射組RGCs密度較模型組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜鋪片熒光金逆行標(biāo)記RGCs染色圖(FG ×200，標(biāo)尺=40 μm) A：對(duì)照組RGCs密度較大 B：模型組RGCs密度較對(duì)照組明顯降低 C：hUC-MSC注射組RGCs密度較模型組升高Figure 3 Fluoro gold retrogradely labeled RGCs staining images of retina stretched preparation in each group(FG ×200,bar=40 μm) A:The RGCs density was high in the control group B:The RGCs density in the model group was lower than that in the control group C:The RGCs density in the hUC-MSC injection group was higher than that in the model group

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，RGCs形態(tài)完整，數(shù)目較多；模型組RGCs數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)核固縮，RGC層變薄萎縮；hUC-MSC注射組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較完整，RGCs數(shù)目較模型組多(圖4)。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)染色結(jié)果(HE ×400，標(biāo)尺=50 μm) A：對(duì)照組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常 B：模型組視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量較對(duì)照組減少，出現(xiàn)核固縮 C：hUC-MSC注射組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)接近對(duì)照組Figure 4 Histopathological staining results of rat retina in each group(HE ×400,bar=50 μm) A:The retinal structure in the control group was normal B:The number of RGCs in the model group was reduced with pyknosis C:The retinal structure in the hUC-MSC injection group was similar to that in the normal group

2.5 各組大鼠RGCs凋亡率變化

對(duì)照組、模型組和hUC-MSC注射組RGCs凋亡率分別為(2.16±1.11)%、(43.47±2.26)%和(20.75±2.18)%，各組RGCs凋亡率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=445.159，P<0.01)；其中模型組和hUC-MSC注射組RGCs凋亡率明顯高于對(duì)照組，hUC-MSC注射組RGCs凋亡率低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5)。

圖5 各組大鼠RGCs凋亡染色圖(TUNEL ×400，標(biāo)尺=50 μm) A：對(duì)照組未見(jiàn)明顯TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞 B：模型組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多 C：hUC-MSC注射組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組減少Figure 4 Apoptosis staining images of RGCs in each group(TUNEL ×400,bar=50 μm) A:No obvious TUNEL-positive cells was found in the retina of the control group B:There were more TUNEL-positive cells in the retina of model group than that of the control group C:There were fewer TUNEL-positive cells in the retina of hUC-MSC injection group than that of the model group

2.6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Bax、Bcl-2、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量變化

對(duì)照組、模型組和hUC-MSC注射組視網(wǎng)膜組織Bax、Bcl-2、p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.982、12.526、73.158，P<0.01)，p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.182，P=0.322)；模型組和hUC-MSC注射組的Bax和p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；hUC-MSC注射組Bax和p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。(圖6，表1)。

表1 各組大鼠Bax、Bcl-2、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 1 Comparison of relative expression levels of Bax,Bcl-2,p38MAPK and p-p38MAPK proteins in rats among various groups (mean±SD)組別樣本量Bax相對(duì)表達(dá)量Bcl-2相對(duì)表達(dá)量p38MAPK相對(duì)表達(dá)量p-p38MAPK相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組100.78±0.080.81±0.090.53±0.050.28±0.04模型組101.12±0.11a0.63±0.07a0.56±0.060.51±0.05ahUC-MSC注射組100.91±0.10ab0.72±0.08ab0.57±0.070.35±0.04abF值30.98212.5261.18273.158P值<0.001<0.0010.322<0.001 注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) hUC-MSC:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;Bax:Bcl-2相關(guān)X蛋白;Bcl-2:B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2;p38MAPK:p38絲裂原活化蛋白激酶;p-p38MAPK:磷酸化絲裂原活化蛋白激酶 Note:Compared with the control group,aP<0.05;compared with the model group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) hUC-MSC:human umbilial cord derived mesenchymal stem cell;Bax:Bcl-2 associated X protein;Bcl-2:B cell lympho-ma /leukemia-2;p38MAPK:p38 mitogen-activated protein kinase;p-p38MAPK:phosphorylated-p38 mitogen-activated protein kinase

圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Bax、Bcl-2、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)電泳圖 模型組和hUC-MSC注射組Bax和p-p38MAPK蛋白表達(dá)條帶較對(duì)照組增強(qiáng)，Bcl-2蛋白條帶較對(duì)照組減弱；hUC-MSC注射組Bax和p-p38MAPK蛋白表達(dá)條帶較模型組減弱，Bcl-2蛋白表達(dá)條帶較模型組增強(qiáng)，各組p38MAPK蛋白表達(dá)條帶強(qiáng)度無(wú)顯著差別 Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2；Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白；p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；p-p38MAPK：磷酸化絲裂原活化蛋白激酶；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白；hUC-MSC:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞Figure 6 Electrophoretogram of Bax,Bcl-2,p38MAPK,p-p38MAPK protein expression of retinal tissues in each group The Bax and p-p38MAPK protein expression bands were stronger and the Bcl-2 protein band was weaker in the model group and the hUC-MSC injection group than those in the control group;the Bax and p-p38MAPK protein expression bands were weaker and the Bcl-2 protein expression band was stronger in the hUC-MSC injection group than those in the model group.There was no significant difference in the intensity of the p38MAPK protein expression bands among the three groups Bcl-2:B cell lymphoma/leukemia-2;Bax:Bcl-2 associated X protein;p38MAPK:p38 mitogen-activated protein kinase;p-p38MAPK:phosphorylated-p38 mitogen-activated protein kinase；hUC-MSC:human umbilial cord derived mesenchymal stem cell

3 討論

DR與糖尿病病程密切相關(guān)，病程越長(zhǎng)DR發(fā)病率越高。高血糖可引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高、電解質(zhì)代謝紊亂，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，還可結(jié)合蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)，引起細(xì)胞損傷和凋亡，導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管病變和神經(jīng)元功能受損[7-8]。細(xì)胞凋亡在DR發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用，DR患者早期可表現(xiàn)出RGCs凋亡現(xiàn)象，而RGCs細(xì)胞凋亡是引起視力下降的主要原因，抑制高糖誘導(dǎo)RGCs細(xì)胞凋亡對(duì)保護(hù)糖尿病患者視力具有重要意義[9-10]。張惟等[11]研究證實(shí)，hUC-MSC能明顯修復(fù)DR大鼠視網(wǎng)膜損傷，對(duì)DR視神經(jīng)損傷具有一定治療作用。另有研究顯示，抑制p38MAPK通路，能夠增強(qiáng)hUC-MSC的組織修復(fù)能力[12]。鑒于hUC-MSC對(duì)神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用且與p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)，本研究探討玻璃體內(nèi)注射hUC-MSCs對(duì)DR模型大鼠RGCs凋亡的抑制作用及對(duì)p38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用。

MSCs是治療多種疾病的細(xì)胞來(lái)源，可分化為神經(jīng)元細(xì)胞，還可分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，對(duì)視網(wǎng)膜退行性病變有良好的效果，對(duì)視神經(jīng)損傷患者視力、閃光型視覺(jué)誘發(fā)電位均有明顯改善效果[13-14]。hUC-MSC是MSCs主要來(lái)源之一，具有干細(xì)胞的一般特點(diǎn)，可向損傷部位定向遷移，修復(fù)組織損傷。已有研究顯示hUC-MSC分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并能表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物，其誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞能增加糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量，表明hUC-MSC具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[15]。本研究結(jié)果顯示，參與造模的大鼠FBG維持在高水平，體質(zhì)量逐漸下降，且視網(wǎng)膜遠(yuǎn)端血管發(fā)生扭曲，毛細(xì)血管出現(xiàn)熒光素滲漏，表明DR模型建立成功。在使用hUC-MSC注射后，RGCs數(shù)量較模型組明顯增多，細(xì)胞凋亡率較模型組明顯降低，視網(wǎng)膜病理學(xué)形態(tài)得到顯著改善，提示hUC-MSC可減少RGCs凋亡，減輕視網(wǎng)膜病理?yè)p傷。Yao等[16]研究顯示，hUC-MSC可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而防止肝臟缺血-再灌注損傷引起的肝細(xì)胞凋亡。Liu等[17]研究表明，hUC-MSC外泌體可抑制H9C2細(xì)胞凋亡。以上研究均提示hUC-MSC在抑制細(xì)胞凋亡方面具有重要作用。基于以上研究，推測(cè)hUC-MSC可抑制RGCs凋亡，對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有一定保護(hù)作用。

Bcl-2是常見(jiàn)凋亡抑制基因，Bax是Bcl-2家族相關(guān)成員之一，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。高糖可激活RGCs內(nèi)MAPK相關(guān)通路，導(dǎo)致Bax和Bcl-2表達(dá)異常，引起細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體損傷，降低RGCs活性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。MAPK信號(hào)通路廣泛存在于各種細(xì)胞中，參與細(xì)胞增生、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程，與DR發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[19]。p38MAPK屬于MAPK經(jīng)典途徑，是多種細(xì)胞信息傳導(dǎo)的共同通路，在應(yīng)激及細(xì)胞因子等因素刺激下，p38MAPK被激活或過(guò)度表達(dá)，形成活性形式p-p38MAPK，繼而誘導(dǎo)Bax蛋白激活并轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體外膜，促進(jìn)腦組織神經(jīng)元細(xì)胞及靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[20-21]。劉高虹等[22]研究表明，高糖可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞p-p38MAPK表達(dá)升高，進(jìn)而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)增加和Bcl-2蛋白表達(dá)減少，參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，模型組視網(wǎng)膜組織中p-p38MAPK蛋白和Bax相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低，推測(cè)視網(wǎng)膜組織p38MAPK信號(hào)通路在DR過(guò)程中被激活，并參與RGCs凋亡過(guò)程；hUC-MSC注射組p-p38MAPK和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組，且Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于模型組，推測(cè)hUC-MSC可能通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路抑制RGCs凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，hUC-MSC對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜損傷具有一定保護(hù)作用，可能通過(guò)阻斷p38MAPK信號(hào)通路來(lái)抑制RGCs凋亡，改善視網(wǎng)膜病理?yè)p傷，從而延緩DR進(jìn)展，為臨床治療DR提供一定理論參考。但本研究?jī)H為在體動(dòng)物水平研究，尚缺乏安全性研究和離體細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，其安全性和有效性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，本研究中僅使用單一劑量進(jìn)行干預(yù)，其是否可作為最適劑量，仍需進(jìn)行劑量實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證效果。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突