徐俏冉 楊欣欣 張珊 王瑤 陳建軍

【摘 要】纖維素是廣泛存在于自然界的多糖類(lèi)物質(zhì)，纖維素酶能有效地將纖維素分解成單糖加以利用，其在能源、紡織、飼料、食品和造紙等行業(yè)具有重要的應(yīng)用。

由于纖維素酶熱穩(wěn)定性較低、酶活力不高而不能滿足生產(chǎn)需要，纖維素酶基因的克隆及表達(dá)日益被人們重視起來(lái)。結(jié)合纖維素酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用及市場(chǎng)化的需求，本文概括了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)纖維素酶基因克隆與表達(dá)的研究進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】纖維素 纖維素酶 基因克隆 工程菌 表達(dá)載體

引言

纖維素在人們賴(lài)以生存的地球上無(wú)處不在，是人們可以利用的可再生資源，但纖維素本身是不可以直接被人們利用的，要先把它降解為可被人利用的物質(zhì)。目前，在降解纖維素的多種方法中，生物法還是較為有效的[1]，它是利用微生物代謝的產(chǎn)物纖維素酶來(lái)降解和轉(zhuǎn)化纖維素，但是在實(shí)際應(yīng)用方面存在產(chǎn)酶活性較低、轉(zhuǎn)化率不高、設(shè)備耗材超出預(yù)算等問(wèn)題，因此構(gòu)建出產(chǎn)酶量多，產(chǎn)酶活性高的纖維素酶基因工程菌對(duì)纖維素資源的有效利用和社會(huì)生產(chǎn)具有重要意義。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)纖維素酶基因的克隆及表達(dá)研究發(fā)展迅速，纖維素酶的應(yīng)用已滲透到人們生產(chǎn)、生活的各個(gè)領(lǐng)域。

1 .纖維素

纖維素是一種多糖，它的化學(xué)簡(jiǎn)寫(xiě)分子式為（C6H10O5） n，它的熱穩(wěn)定性很好，在室溫條件下，不易降解，不易分解，一般條件下，并不發(fā)生顯著的變化[2]。以150℃為界限，溫度高到一定程度時(shí)，也會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。纖維素與無(wú)機(jī)酸，苛性堿溶液以及強(qiáng)氧化劑均可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[3]。

2 . 纖維素酶

2.1 纖維素酶的組成

纖維素酶由三部分組成，分別是：外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，它是靠這三種酶共同作用，來(lái)發(fā)揮自己的功效的[4]。纖維素酶的最適pH一般在4.5-6.5，過(guò)酸或者過(guò)堿都可以使酶失活。纖維素酶活力還算比較穩(wěn)定，但是，目前人們發(fā)現(xiàn)了一些抑制劑，可以抑制酶的活力，比如銅離子和汞離子，而相對(duì)應(yīng)的，還有些物質(zhì)可以解除這種抑制，它就是半胱氨酸[5]，我們可以有效的利用它，來(lái)最大程度的發(fā)揮酶的活力。

2.2纖維素酶的來(lái)源

纖維素酶無(wú)處不在，真菌，細(xì)菌，放線菌中都有產(chǎn)纖維素酶的菌[6]。目前，報(bào)道過(guò)的產(chǎn)纖維素酶的菌株主要集中在真菌方面，如黑曲霉Aspergillus Niger、綠色木霉Green trichoderma viride、里氏木霉Magnitude of trichoderma viride、康氏木霉Kang Shimu mildew和嗜熱毛殼菌 QM9381Bacteria QM9381， thermophilic MAO shells 等[7]；細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)的并不多，如芽孢桿菌Bacillus、瘤胃細(xì)菌Rumen bacteria（黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等）和熱纖梭菌Thermal fiber clostridium等。

2.3 纖維素酶的作用機(jī)理

纖維素酶降解纖維素的過(guò)程中，首先纖維素酶要結(jié)合到底物上，形成酶-纖維素二元復(fù)合物，完成纖維素酶降解纖維素的第一步，即吸附[8]。由于吸附的條件不同，吸附的效果也不同。內(nèi)切葡聚糖酶先發(fā)揮作用后，外切葡聚糖酶再發(fā)揮作用，β-葡萄糖苷酶與其二者協(xié)同作用，共同將纖維素分解為葡萄糖。內(nèi)切葡聚糖酶先作用于微纖維的非結(jié)晶區(qū)，將其分解成大小不等的短鏈，外切葡聚糖酶作用于這些短鏈，生成纖維二糖，最后β-葡萄糖苷酶作用于纖維二糖等，生成葡萄糖。

2.4 纖維素酶的應(yīng)用

纖維素酶在食品發(fā)酵工業(yè)、動(dòng)物飼料行業(yè)、紡織和造紙行業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用，在石油勘探、中藥成分的提取等領(lǐng)域中也有所涉及。在酒精生產(chǎn)中，添加纖維素酶不僅可以提高啤酒的純度和啤酒生產(chǎn)的速度，而且可以保證啤酒的質(zhì)量及提高啤酒的口感[9]。在飼料中，添加纖維素酶不僅可以促進(jìn)消化，還有利于提高家畜的體重[10]。在紡織行業(yè)中，采用纖維素酶對(duì)織物進(jìn)行洗滌時(shí)，其可以對(duì)纖維表層進(jìn)行有效的控制，從而使織物均勻褪色[11]。

3 .纖維素酶基因克隆及表達(dá)的研究

隨著分子生物學(xué)、遺傳工程的迅猛發(fā)展，國(guó)內(nèi)外均在嘗試應(yīng)用基因工程技術(shù)來(lái)改造和構(gòu)建高效纖維素降解菌，而且對(duì)特殊環(huán)境中的纖維素酶產(chǎn)生菌也產(chǎn)生了濃厚的興趣。這些菌具有獨(dú)特的酶學(xué)性質(zhì)，擴(kuò)大了纖維素酶的應(yīng)用范圍[12]。

在20 世紀(jì)70 年代，纖維素酶基因的克隆開(kāi)始興起并蓬勃發(fā)展起來(lái)。到目前為止，人們克隆到纖維素酶的基因并不是單一的，在成千上萬(wàn)個(gè)物種中都有發(fā)現(xiàn)與收獲，其中在細(xì)菌和真菌中尤其廣泛[13]。同時(shí)，克隆到的酶基因能否成功的表達(dá)也十分重要，已有文獻(xiàn)證明纖維素酶在大腸桿菌中表達(dá)是比較普遍而且高效的[14]，另外，人們還在逐步尋找其他的表達(dá)載體。但是與國(guó)外相比，國(guó)內(nèi)對(duì)纖維素酶的研究還很緩慢，很多菌株因?yàn)楫a(chǎn)酶能力低或者熱穩(wěn)定性差而不能被很好的應(yīng)用。

如今，很多學(xué)者已克隆出不少的纖維素酶基因，而且其中一大部分都在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)[15]。

寧玉潔等[16]從約氏梭菌屬CJ-1菌株中克隆出基因片段Cel9C，大小為1943 bp，編碼647個(gè)氨基酸，將該基因構(gòu)建于大腸桿菌表達(dá)載體pET28a（+）中，獲得重組表達(dá)載體pET28a-Cel9C，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。

Kim等[17]將耐熱菌Aqu ifex aeolicus VF5中編碼耐熱內(nèi)切葡聚糖酶的基因（Cel8Y）克隆并且轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌XL1-Blue中，通過(guò)表達(dá)和檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)切葡聚糖酶在80℃時(shí)酶活最大。

李春華等[18]以CpoI and NotI限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切衍生于質(zhì)粒pGEX的大腸桿菌表達(dá)載體pHBM625，然后將經(jīng)T4 DNA polymerase處理后的β-1， 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因克隆至載體pHBM625中得到重組質(zhì)粒pHBM625中，最后通過(guò)平板檢測(cè)及SDS-PAGE凝膠電泳，均檢測(cè)到該基因在大腸桿菌XL10-Glod中的表達(dá)。

雖然纖維素酶克隆與表達(dá)的研究在現(xiàn)階段已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但表達(dá)、分泌均較弱，并沒(méi)有在真正意義上得到高效分解纖維素的工程菌，不能大規(guī)模的應(yīng)用于生產(chǎn)[19]。由此觀之，雖然纖維素酶具有廣闊的應(yīng)用前景和良好的發(fā)展前途，但人們對(duì)纖維素的世界了解的還不夠深入透徹，有很多未知的領(lǐng)域等待我們探索和突破，另外，纖維素酶還有良好的商業(yè)價(jià)值，人們?cè)谏a(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域，如果能使纖維素酶發(fā)揮出應(yīng)有的功效，那將是酶工程的一項(xiàng)重大突破[20]。

4 . 展望

迄今為止，很多纖維素的潛在資源沒(méi)有被人們利用，既造成了環(huán)境污染，也浪費(fèi)了資源，并對(duì)物質(zhì)資源造成了很大的壓力[21]。有研究報(bào)道顯示，我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，很多玉米等谷物的麥稈都被焚燒，世界的麥稈每年產(chǎn)量約40億噸，光被我國(guó)燃燒掉的就占了八分之一，如果我們可以把這些資源利用起來(lái)，變廢為寶，不僅可以緩解環(huán)境的壓力，也可以很好的解決資源浪費(fèi)的問(wèn)題。很多發(fā)達(dá)國(guó)家的纖維素的利用率比我國(guó)高出了五分之一，所以，我們應(yīng)該學(xué)習(xí)他們的先進(jìn)技術(shù)，努力構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶的基因工程菌，并把它用于生產(chǎn)實(shí)踐，解決我國(guó)纖維素資源浪費(fèi)的問(wèn)題。相信在不久的將來(lái)，纖維素酶會(huì)在我們生活的各個(gè)領(lǐng)域發(fā)展壯大，將會(huì)給人們帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，會(huì)給商品化社會(huì)帶來(lái)推動(dòng)作用，會(huì)更加便于人類(lèi)的生活。

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通訊作者：陳建軍