薛璐瑜，周文紅，余煉，李雨霖，鄧雨萍，劉小玲

(廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧，530000)

小球藻(Chlorella)屬于單細胞真核微藻，我國常見的有普通小球藻(C.vulgaris)、蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和橢圓小球藻(C.ellipoidea)等[1-3]。小球藻中含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、多糖、維生素、微量元素和一些生物活性物質(zhì)等[4-7]。小球藻生長因子(chlorella growth factor, CGF)，也叫小球藻精,是一種由新鮮優(yōu)質(zhì)的小球藻細胞經(jīng)多次離析濃縮和萃取提取到的有較高營養(yǎng)價值的活性物質(zhì)。由于小球藻具有藻類特有的腥味，在應用于食品開發(fā)時還需要進一步加工以去除或遮蓋腥味，尤其在制備飲品時脫腥是關鍵[6, 8-9]。

目前，已經(jīng)開發(fā)的脫腥方法主要有包埋法、吸附法、遮蔽法、酵母發(fā)酵等。包埋法與遮蔽法主要是通過包裹或掩蓋腥味物質(zhì)，以達到脫腥效果，但由于包埋劑及遮蔽劑添加量限制，包埋遮蔽效果有限，需要與其他方法同時使用才能達到較好的脫腥效果；吸附法主要是通過將腥味物質(zhì)與有效成分分離達到脫腥效果，但無法保證只吸附腥味物質(zhì)；通過酵母發(fā)酵法脫腥，一方面是酵母本身疏松的結(jié)構對腥味物質(zhì)具有類似活性炭的吸附作用，另一方面酵母中含有的某些酶對腥味物質(zhì)有一定的酶解作用，但酶解可能會破壞一些蛋白質(zhì)類功能成分。本文以加熱法、包埋法、遮蔽法為單因素，研究了兩種復合脫腥法工藝，旨在找到一種較好的脫腥方法，為進一步制備小球藻生長因子飲品提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

小球藻生長因子液，廣西生巴達生物科技有限公司；β-環(huán)狀糊精(食品級，市售)，孟州市華興生物化工有限責任公司；茉莉花粉(食品級，市售)，楓之味(福建)生物科技有限公司；綠茶提取物(食品級，市售)，陜西嘉禾生物。

FlavourSpec?食品風味分析儀含CTC自動頂空進樣器，德國 G.A.S 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素脫腥工藝

1.2.1.1 加熱法脫腥

取5 mL小球藻生長因子液，在保證其他條件相同的情況下，水浴加熱30、45、60、75、90 min；取5 mL小球藻生長因子液，在保證其他條件相同的情況下，水浴加熱40、50、60、70、80 ℃，冷卻后以表1腥味值為評價指標進行腥味感官評價[10]。

1.2.1.2 包埋法脫腥

取5 mL小球藻生長因子液，常溫下添加β-環(huán)糊精作為包埋劑，充分搖勻后靜置5 min，確保β-環(huán)糊精溶解完全。控制β-環(huán)糊精的添加量(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/100mL)變化，以表1腥味值為評價指標進行腥味感官評價[10]。

1.2.1.3 遮蔽法脫腥

取5 mL小球藻生長因子液，常溫下添加茉莉花粉和綠茶提取物作為遮蔽劑，充分搖勻?？刂栖岳蚧ǚ鄣奶砑恿?1、2、3、4、5 g/100mL)變化；控制綠茶提取物的添加量(1、2、3、4、5 g/100mL)變化，以表1腥味值為評價指標進行腥味感官評價[10]。

表1 腥味評價表Table 1 Fishy smell evaluation form

1.2.2 復合脫腥工藝

1.2.2.1 包埋-加熱復合法

在單因素試驗的基礎上，選取包埋法和加熱法交互脫腥，分別取5 mL小球藻生長因子液，選取β-環(huán)糊精添加量、加熱溫度、加熱時間為3個單因素，以表2 L9(33)正交表進行試驗[10]。

表2 包埋法-加熱復合法因素水平表Table 2 Factor level table of embedding heating composite method

1.2.2.2 遮蔽-加熱復合法

在單因素試驗的基礎上，選取遮蔽法和加熱法交互脫腥，分別選取茉莉花粉(添加量)/綠茶提取物添加量、加熱溫度、加熱時間為3個單因素，以表3、表4 L9(33)正交表進行試驗[11]。

表3 遮蔽-加熱復合法因素水平表Table 3 Factor level table of shielding heating composite method

1.2.3 氣相-離子遷移譜(gas chromatography-lon mobility spectrometry,GC-IMS)分析方法

參照顧賽麒等[12]、邵悅春等[13]的方法略作修改。取1 mL樣品至20 mL頂空進樣瓶，設置1組平行對照，準備進樣。孵化溫度60 ℃，孵化時間10 min，進樣方式為頂空進樣，進樣體積500 μL，進樣針溫度65 ℃，加熱方式為振蕩加熱，振蕩速度500 r/min，不分流，清洗時間5 min。

色譜柱FS-SE-54-CB-1；石英毛細管柱(15 m×0.53 mm，0.5 μm)；色譜柱溫度50 ℃；載氣N2(純度≥99.999%)；載氣流速：初始流速 0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～15 min，15～100 mL/min；15～20 min，100 mL/min；20～25 min，100～150 mL/min；分析時間25 min。

漂移管長度98 mm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣N2(純度≥99.999%)；漂移氣流量150 mL/min；放射源β射線(氚，3H)；離子化模式，正離子。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26、Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和繪圖。通過GC-IMS自帶的LAV軟件制作揮發(fā)性物質(zhì)(volatile organic compounds，VOCs)二維譜圖、定性、指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素脫腥效果分析

2.1.1 加熱法脫腥效果

在不同加熱時間下，小球藻生長因子液脫腥后腥味值變化如由圖1-a所示，隨著加熱時間的增長，脫腥值呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，當加熱時間為75 min時，其腥味值降到最低。在不同加熱溫度下，小球藻生長因子液脫腥后腥味值變化如由圖1-b所示，當脫腥溫度為40 ℃時，其腥味值最低；當脫腥溫度>40 ℃時，其腥味值隨著溫度的升高呈逐漸升高的趨勢，表明腥味并沒有隨著反應溫度的升高而減弱。綜合結(jié)果分析，小球藻生長因子液在加熱40 ℃、75 min時，脫腥效果較好。張麗君等[11]研究發(fā)現(xiàn)在加熱60 ℃、30 min時脫腥效果最佳，并認為溫度過高會使螺旋藻溶液產(chǎn)生異味，所以小球藻生長因子液的腥味值隨著溫度的升高呈逐漸升高的趨勢；陽暉等[14]在對螺旋藻脫腥工藝篩選時發(fā)現(xiàn)，在加熱40 ℃、30 min時脫腥效果較好，時間過長會產(chǎn)生沉淀，但小球藻生長因子液經(jīng)過多次離析濃縮和萃取，在一定溫度下，隨著加熱時間的增長，其脫腥值呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。

a-加熱時間；b-加熱溫度圖1 加熱法對小球藻生長因子液脫腥效果影響Fig.1 Effect of heating on deodorization of chlorella growth factor solution注：不同小寫表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 包埋法脫腥效果

在不同β-環(huán)糊精添加量下，小球藻生長因子液脫腥后腥味值變化如由圖2所示，當添加量為0.03 g/100mL時，其腥味值最低，添加量增加，腥味值逐漸平穩(wěn)，可能由于β-環(huán)糊精包埋已經(jīng)達到最大程度。大量文獻研究發(fā)現(xiàn)[15-17]，β-環(huán)糊精可以通過將小分子物質(zhì)包埋達到脫腥效果，但包埋程度有限，可以同其他脫腥方法交互脫腥。

圖2 包埋法對小球藻生長因子液脫腥效果影響Fig.2 Effect of embedding method on deodorization of chlorella growth factor solutiont

2.1.3 遮蔽法脫腥效果

如圖3所示，當添加量為1 g/100mL時，腥味值最低，隨著茉莉花粉和綠茶提取物添加量的增長，脫腥值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，可能由于茉莉花粉和綠茶提取物的香氣與小球藻生長因子液的氣味相互疊加，使氣味不被人接受。龐庭才等[10]添加薄荷香精遮蔽腥味；張曉梅[18]添加綠茶與β-環(huán)糊精復合脫腥，得到呈淡綠色、基本無腥味，有淡淡的綠茶香味的羊棲菜提取液。

a-茉莉花粉添加量；b-綠茶提取物添加量圖3 遮蔽法對小球藻生長因子液脫腥效果影響Fig.3 Effect of shading on deodorization of chlorella growth factor solution

2.2 不同復合脫腥效果分析

2.2.1 包埋-加熱復合法正交試驗結(jié)果分析

由表4極差分析可知，影響小球藻生長因子液腥味值主次因素的關系為：A>B>C，對小球藻生長因子液腥味值影響最顯著為β-環(huán)糊精添加量。由正交設計得到各個因素的最優(yōu)組合為A2B2C3，即加熱溫度50 ℃、加熱時間90 min、β-環(huán)糊精添加量0.03 g/100mL。

表4 包埋-加熱復合法正交因素水平表Table 4 Factor level table of orthogonal test of heating composite method

2.2.2 遮蔽-加熱復合法正交試驗結(jié)果分析

2.2.2.1 茉莉花粉正交試驗結(jié)果分析

由表5極差分析可知，影響小球藻生長因子液腥味值主次因素的關系為：A>B=C，對小球藻生長因子液腥味值影響最顯著為茉莉花粉添加量。由正交設計得到各個因素的最優(yōu)組合為A1B1C1，即加熱溫度40 ℃、加熱時間60 min、茉莉花粉添加量1 g/100mL。

表5 遮蔽-加熱復合法正交因素水平表Table 5 Factor level table of orthogonal test of shielding heating composite method

2.2.2.2 綠茶提取物正交試驗結(jié)果分析

由表6極差分析可知，影響小球藻生長因子液腥味值主次因素的關系為：C>B>A，對小球藻生長因子液腥味值影響最顯著為加熱時間。由正交設計得到各個因素的最優(yōu)組合為A2B2C3，即加熱溫度50 ℃、加熱時間90 min、綠茶提取物添加量2 g/100mL。此結(jié)果為設計方案中試驗5，為最優(yōu)結(jié)果，無需進行驗證實驗。

表6 遮蔽-加熱復合法正交因素水平表Table 6 Factor level table of orthogonal test of shielding heating composite method

2.3 不同脫腥方法小球藻生長因子揮發(fā)性風味物質(zhì)比較

2.3.1 不同脫腥方法小球藻生長因子二維譜圖分析

圖4為小球藻生長因子液與經(jīng)β-環(huán)糊精、茉莉花粉、綠茶提取物脫腥后的小球藻生長因子液的GC-IMS二維譜圖及二維離子遷移譜差異圖。由圖4-a可以看出4個樣品的各VOCs分離狀況良好，在4個樣品的二維譜圖中共發(fā)現(xiàn)51個待分析峰。根據(jù)圖4-b離子遷移譜差異圖可以看出，原液與β-環(huán)糊精脫腥樣品的差異集中在保留時間300～800，原液與茉莉花茶粉脫腥樣品、綠茶提取物脫腥樣品的差異集中在1 000～1 400。

a-二維譜圖；b-二維離子遷移譜圖4 脫腥前后小球藻生長因子液的GC-IMS二維譜圖及二維離子遷移譜差異圖Fig.4 GC-IMS two-dimensional spectrum and two-dimensional ion mobility spectrum of chlorella growth factor solution before and after deodorization

2.3.2 不同脫腥方法小球藻生長因子液VOCs定性

參考ZHOU等[19]的方法，通過GC-IMS內(nèi)置的NIST2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫定性，在4個樣品中共檢測到的51個VOCs，共定性32種VOCs。由表7所示，定性出的VOCs包含醇類7種、酯類4種、酮類7種、醛類6種、苯類4種、烯烴類2種；其中，1-辛烯-3-醇、2,3-戊二酮、2-戊酮等C5化合物被發(fā)現(xiàn)為小球藻中的典型揮發(fā)性化合物[20-21]；在已定性的32種VOCs中，4組樣品中共定性出醇類化合物7種，其中有5種VOCs在茉莉花粉脫腥樣品中檢測到，芳樟醇為茉莉花特征風味之一[22]，葉醇為綠茶特征風味之一[23]，可以為小球藻生長因子液增加香氣；使用β-環(huán)糊精脫腥后的樣品與原液相比，醛類化合物種類明顯減少，醛類化合物有很強的疊加效應[24]，在原液中主要呈現(xiàn)刺激性氣味，β-環(huán)糊精可以一定程度減少小球藻生長因子液中的不被人接受的氣味。

表7 脫腥前后小球藻生長因子液的 GC-IMS 揮發(fā)性組分定性Table 7 Characterization of volatile components of chlorella growth factor solution before and after deodorization by GC-IMS

2.3.3 不同脫腥方法小球藻生長因子液指紋圖譜結(jié)果分析

參考楊曉璇等[24]的方法，基于4個樣品的GC-IMS二維譜圖中VOCs數(shù)據(jù)建立的指紋圖譜(圖5)。在指紋圖譜中可以明顯看出4組樣品VOCs種類和相對含量的異同，且大致可按組分類；A框區(qū)域為4種樣品中相對含量都較高的VOCs；B框區(qū)域為β-環(huán)糊精脫腥樣品中相對含量或種類減少的VOCs；C框區(qū)域為茉莉花茶脫腥樣品和綠茶提取物脫腥樣品為小球藻生長因子液增加的VOCs。

圖5 脫腥前后小球藻生長因子液的GC-IMS指紋圖譜Fig.5 GC-IMS fingerprint of chlorella growth factor solution before and after deodorization注：圖中每一行代表一種樣品，每一列代表一種VOCS物質(zhì)，數(shù)字代表未定性出物質(zhì)

3 結(jié)論與討論

本文對3種小球藻生長因子液脫腥方法進行了研究，通過單因素試驗，確定小球藻生長因子液的最佳加熱溫度為40 ℃、加熱時間為75 min、β-環(huán)糊精添加量0.03 g/100mL、茉莉花粉添加量1 g/100mL、綠茶提取物添加量1 g/100mL；通過正交試驗對復合脫腥工藝進行優(yōu)化，優(yōu)化獲得包埋-加熱復合脫腥法：加熱溫度50 ℃、加熱時間90 min、β-環(huán)糊精添加量0.03 g/100mL。優(yōu)化獲得遮蔽-加熱復合脫腥法，茉莉花粉遮蔽：加熱溫度40 ℃、加熱時間60 min、茉莉花粉添加量1 g/100mL；綠茶提取物脫遮蔽：加熱溫度50 ℃、加熱時間90 min、綠茶提取物添加量2 g/100mL。

通過GC-IMS分析可知，脫腥前后樣品中定性出32中揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類7種、酯類4種、酮類7種、醛類6種、苯類4種、烯烴類2種。使用茉莉花粉和綠茶提取物脫腥前后主要增加的為醇類化合物，為小球藻生長因子液增加了愉悅氣味；1-辛烯-3-醇、2,3-戊二酮、2-戊酮等C5化合物被發(fā)現(xiàn)為小球藻中的典型揮發(fā)性化合物，使用β-環(huán)糊精脫腥后C5化合物種類明顯減少，減少小球藻生長因子液中的不被人接受的氣味。

綜上所述，使用β-環(huán)糊精脫腥可以包埋小球藻生長因子液中部分刺激性氣味，降低腥味值；使用茉莉花茶和綠茶提取物掩蓋小球藻生長因子液中不被人接受的氣味，同時還會為小球藻生長因子液增加令人愉悅的氣味，從而降低腥味值，本文為小球藻生長因子風味飲料的生產(chǎn)應用提供了技術和理論支持。