翟弋焱,陳美琳,黃佳奇,時(shí) 銳,伍 超,張景媛,張繁芹,王 偉,程國(guó)良,李 冰,譚影影,黃志鴻,巫志姍,吳嘉瑞#(.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 0009;.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司醫(yī)學(xué)部,山東臨沂 76005)

痔瘡為臨床常見的疾病,而且發(fā)病因素較為復(fù)雜,受到自身生理因素與外界環(huán)境因素的共同影響,同時(shí)該病復(fù)發(fā)率高,難以完全治愈[1]。國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,痔瘡的發(fā)病率占肛腸類疾病的87.25%[2]。中醫(yī)治療痔瘡的歷史非常悠久。張仲景在《金匱要略》中已經(jīng)記載,“先血后便,此近血也,赤小豆當(dāng)歸散主之”,提出了鑒別痔瘡出血的方法以及對(duì)應(yīng)的治療方藥。孫思邈的《千金要方》中記載了多首內(nèi)治方藥,如槐子丸、刺皮丸和內(nèi)補(bǔ)散等,沿用至今也有明顯療效[3]。中醫(yī)認(rèn)為,痔瘡主要是由久坐、久蹲、便秘、瀉痢、情志失調(diào)和氣血虛等因素影響臟腑功能,再加上風(fēng)、濕、熱等邪氣下迫大腸阻滯于肛門從而產(chǎn)生[4]。中醫(yī)對(duì)于痔瘡的治療主要為內(nèi)治法與外治法。內(nèi)治法以湯劑和中成藥為主,多使用清熱解毒、清熱涼血、活血化瘀和清熱燥濕類藥物;外治法以散、膏、栓等劑型為主,直達(dá)病位進(jìn)行治療[5]。脈絡(luò)舒通丸由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術(shù)、薏苡仁、玄參、當(dāng)歸、白芍、甘草、水蛭、全蝎和蜈蚣12 味藥組成,諸藥配伍,共奏清熱解毒、利濕消腫、化瘀通絡(luò)之功,在臨床常被用于治療濕熱瘀阻脈絡(luò)之靜脈血管血栓性疾病,但其治療痔瘡的具體作用機(jī)制尚不明確,值得深入研究。因此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,結(jié)合分子對(duì)接技術(shù),探討脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 脈絡(luò)舒通丸活性成分的篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,http://tcmspw.com/),以“黃芪”“金銀花”“黃柏”“蒼術(shù)”“薏苡仁”“玄參”“當(dāng)歸”“白芍”“甘草”“水蛭”“蜈蚣”和“全蝎”為關(guān)鍵詞檢索脈絡(luò)舒通丸中的化學(xué)成分。進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的設(shè)置:口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18。同時(shí)檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫(kù)、PubMed 等數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于脈絡(luò)舒通丸化學(xué)成分研究的文獻(xiàn),對(duì)脈絡(luò)舒通丸的化合物進(jìn)行補(bǔ)充。以上述操作篩選后的成分作為活性成分,使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)查詢靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2 痔瘡相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

使用DisGeNET(https://www.Disgenet.org/search/) 和GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),檢索關(guān)鍵詞為“hemorrhoids”,獲得疾病基因,合并2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果,去除重復(fù)項(xiàng)后得到痔瘡的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 脈絡(luò)舒通丸化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建脈絡(luò)舒通丸化學(xué)成分與相關(guān)靶點(diǎn)的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)度值、緊密度和介數(shù)等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行篩選得到關(guān)鍵的靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與模塊分析

對(duì)脈絡(luò)舒通丸靶點(diǎn)與痔瘡的靶點(diǎn)取交集,經(jīng)過STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)分析得到PPI 網(wǎng)絡(luò),將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行分析,利用MCODE 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

使用R 軟件對(duì)模塊分析后獲得的脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的關(guān)鍵基因進(jìn)行GO 與KEGG 分析,再利用R 軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接

對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的介數(shù)、緊密度和度值3 個(gè)參數(shù)進(jìn)行篩選得到8 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),對(duì)這些靶點(diǎn)與其相對(duì)應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對(duì)接。從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得這些化合物的SDF 格式文件,使用Chem 3D 19.0軟件將其轉(zhuǎn)變?yōu)閜db 格式文件。利用軟件設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵與活動(dòng)鍵時(shí)需要移動(dòng)的最少的原子數(shù)目,將其保存為PDBQT 格式。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)篩選獲得,同時(shí)刪除所獲得蛋白質(zhì)中的水分子、原小分子配體等。利用Autodock Tools 1.5.6 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加電荷、加氫等操作,然后設(shè)置Grid Box 坐標(biāo)與盒子大小。最后,使用Autodock Vina 1.1.2 進(jìn)行運(yùn)算對(duì)接。整理分析對(duì)接結(jié)果,根據(jù)結(jié)合能進(jìn)行排序,選擇結(jié)合能最低的對(duì)接結(jié)果使用PyMol 2.3.2 軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖包括525 個(gè)節(jié)點(diǎn),3 121 條邊,其中215個(gè)化合物和310 個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián),見圖1。

2.2 潛在靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

對(duì)化合物的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)取交集得到148 個(gè)交集靶點(diǎn),制作韋恩圖,見圖2。將交集靶點(diǎn)通過STRING 網(wǎng)站進(jìn)行分析,將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件制作PPI 網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。圖3 中,每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小代表了其度值,顏色由淺到深代表了緊密中心由大到小;圖中有143 個(gè)節(jié)點(diǎn),1 835 條邊。使用MCODE 插件進(jìn)行模塊分析,進(jìn)行模塊可視化,見圖4。聚類得分高的模塊意味著其中的靶點(diǎn)關(guān)系更密切,共同參與某種生物途徑。

圖2 脈絡(luò)舒通丸與痔瘡的交集靶點(diǎn)圖Fig 2 Target map of intersection between Mailuo Shutong pills and hemorrhoids

圖3 脈絡(luò)舒通丸相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network of Mailuo Shutong pills related targets

圖4 脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的PPI 網(wǎng)絡(luò)模塊Fig 4 PPI network module of Mailuo Shutong pills in the treatment of hemorrhoids

2.3 GO 功能富集與KEGG 通路富集分析

對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)與模塊都進(jìn)行GO 功能富集與KEGG 通路富集分析。對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)的分析共得到161 條KEGG 通路,3 041 條GO 功能條目。GO 功能條目中,包括2 706 條生物過程(BP)相關(guān)條目,140 條細(xì)胞成分(CC)相關(guān)條目,195 條分子功能(MF)相關(guān)條目,P值最低的10 個(gè)生物過程相關(guān)條目為對(duì)化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)生物質(zhì)量調(diào)控、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、多細(xì)胞生物過程的調(diào)控、細(xì)胞對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)外部刺激的反應(yīng)、對(duì)含氧化合物的響應(yīng)、細(xì)胞群體增殖和對(duì)分子功能的正向調(diào)節(jié);KEGG 通路富集分析中,P值最低的前20 條通路為癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號(hào)通路、蛋白多糖與癌癥、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、乙型肝炎、化學(xué)致癌-受體激活、前列腺癌、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE 受體(RAGE)信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、丙型肝炎、甲型流感、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、細(xì)胞凋亡、流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、癌癥的中樞碳代謝、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌及膀胱癌,見圖5—6。

圖5 脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡PPI 網(wǎng)絡(luò)模塊GO 和KEGG 富集分析結(jié)果Fig 5 GO and KEGG enrichment analysis of PPI network module of Mailuo Shutong pills in the treatment of hemorrhoids

2.4 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

對(duì)模塊網(wǎng)絡(luò)中的度值、緊密度和介數(shù)3 個(gè)參數(shù)進(jìn)行篩選得到8 個(gè)核心基因,分別為蛋白激酶B(Akt)1、腫瘤蛋白p53(TP53)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、雌激素受體1(ESR1)、缺氧誘導(dǎo)因子1A(HIF1A)和腫瘤壞死因子(TNF)。對(duì)其進(jìn)行分析,選擇其中的部分通路進(jìn)行了可視化,見圖7;將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖,見圖8。

圖6 脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡PPI 網(wǎng)絡(luò)GO 和KEGG 富集分析結(jié)果Fig 6 GO and KEGG enrichment analysis of PPI network of Mailuo Shutong pills in the treatment of hemorrhoids

圖7 脈絡(luò)舒通丸作用于MAPK 信號(hào)通路示意圖Fig 7 Schematic diagram of MAPK signaling pathway acted by Mailuo Shutong pills

圖8 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 8 Drug-component-target-pathway network

2.5 分子對(duì)接

使用AutoDockTools 1.5.6 軟件對(duì)8 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相對(duì)應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對(duì)接。選擇部分對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理,見圖9。一般來說,結(jié)合能越小,對(duì)接效果越好。

圖9 分子對(duì)接Fig 9 Molecular docking

3 討論

痔瘡是肛管皮膚下靜脈叢擴(kuò)張、屈曲形成的柔軟靜脈團(tuán),其主要特征為肛門疼痛、有墜脹感、瘙癢和肛周濕疹等。該病是常見的肛腸類疾病,可發(fā)生于任意年齡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),痔瘡在20～40 歲人群中較多見,且隨著年齡的增長(zhǎng)而加重[6]。部分患者由于患有痔瘡,恐懼排便,久之導(dǎo)致便秘,反而加重原有痔瘡的病情。余文美等[7]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),脈絡(luò)舒通丸對(duì)于痔瘡過程中的紅腫熱痛以及術(shù)后的創(chuàng)面恢復(fù)具有顯著療效,能有效抑制炎癥反應(yīng)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的方法預(yù)測(cè)了脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的作用機(jī)制。通過數(shù)據(jù)庫(kù)與文獻(xiàn)檢索得到脈絡(luò)舒通丸中的215 個(gè)化合物與310 個(gè)靶點(diǎn),通過關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選以及分子對(duì)接的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了脈絡(luò)舒通丸發(fā)揮作用可能的關(guān)鍵化學(xué)成分。如芒柄花素是黃芪和甘草中的化學(xué)成分,為異黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化、提高免疫功能、抗腫瘤及雌激素樣作用等功效[8]。張彥平等[9]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),芒柄花素可以提升小鼠胸腺及脾臟的T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)小鼠免疫相關(guān)細(xì)胞因子、淋巴細(xì)胞增殖,進(jìn)一步提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的功能。槲皮素是黃芪、黃柏、金銀花和甘草的共有化學(xué)成分,為黃酮類化合物,具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫等功效[10]。司麗君等[11]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),槲皮素具有良好的抗炎活性,能減少炎癥細(xì)胞活性氧和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的釋放,可以選擇性抑制環(huán)氧合酶2(COX-2),還能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。任改艷等[12]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了槲皮素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠RAW264.7 細(xì)胞炎癥具有抑制作用,具體的機(jī)制可能是槲皮素參與調(diào)控Toll 樣受體4/核因子κB(NF-κB)通路,從而抑制COX-2 和細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α 及白細(xì)胞介素1β 的表達(dá)。木犀草素是金銀花的活性成分,為黃酮類化合物,具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化和抗病毒等多種功效[13]。研究結(jié)果表明,木犀草素具有顯著的抗炎作用,主要通過降低多種促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6 和白細(xì)胞介素8 等)、趨化因子(如MCP-1)的表達(dá)而發(fā)揮作用[14]。木犀草素的抗炎活性還與其調(diào)控促炎基因相關(guān)。NF-κB 是促炎基因表達(dá)調(diào)節(jié)的因子之一,正常情況下NF-κB 與其抑制蛋白互相結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中不表達(dá)活性,一旦受到刺激,抑制蛋白被降解,NF-κB 被釋放,從而誘導(dǎo)多種靶基因轉(zhuǎn)錄,加劇炎癥反應(yīng)[15-16]。Kim 等[17]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),木犀草素可以通過干擾P300 與TNF-α 啟動(dòng)子區(qū)間結(jié)合,減少乙?；?HAT)與NF-κB 和TNF-α 乙酰化的相互作用,進(jìn)而抑制NF-κB 下游促炎因子轉(zhuǎn)錄,減輕炎癥反應(yīng)。漢黃芩素是蒼術(shù)的活性成分,為黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和神經(jīng)保護(hù)等功效。有研究結(jié)果表明,漢黃芩素能抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)一氧化氮和前列腺素E2 的產(chǎn)生,同時(shí)對(duì)COX-2 有直接的抑制作用[18]。Tang 等[19]發(fā)現(xiàn),漢黃芩素能夠提高自然殺傷細(xì)胞的殺傷作用和巨噬細(xì)胞的吞噬作用,劑量依賴性地增加細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1α、TNF-α 的轉(zhuǎn)錄水平,抑制NF-κB 的下游表達(dá),表明漢黃芩素有良好的抗炎活性。

對(duì)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,同時(shí)查閱相關(guān)文獻(xiàn),最終發(fā)現(xiàn)Akt1、TP53、IL-6、EGFR、VEGFA、ESR1、HIF1A 和TNF 可能是藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。脈絡(luò)舒通丸可能通過抑制炎癥反應(yīng)、提高免疫和促進(jìn)細(xì)胞增殖等多個(gè)分子機(jī)制來發(fā)揮治療痔瘡的作用。在痔瘡的發(fā)生發(fā)展以及愈合的過程中會(huì)引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)[20]。IL-6、TNF-α 是重要的促炎因子,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[21-23]。IL-6、TNF-α 等炎癥因子所誘導(dǎo)的免疫機(jī)制在抗菌抗感染的同時(shí),也會(huì)不可避免的對(duì)感染部位造成一定的炎癥病理性損害[24-25]。林巧娟等[26]對(duì)大鼠痔瘡術(shù)后的創(chuàng)面愈合階段中血清炎癥因子的表達(dá)量進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)使用肛愈散治療后IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)量均顯著降低。分子對(duì)接結(jié)果表明,脈絡(luò)舒通丸中槲皮素、木犀草素等化合物與IL-6、TNF-α 有較強(qiáng)的結(jié)合能力,并且能抑制TNF-α、IL-6 的產(chǎn)生[27]。EGFR 是廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上的糖蛋白,具有酪氨酸激酶的活性,EGFR 及其配體是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分,研究結(jié)果表明,EGFR 的信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)乎細(xì)胞的凋亡、增殖、分化、遷移和細(xì)胞周期循環(huán)[28]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGFR 可以加速創(chuàng)面細(xì)胞分裂,促進(jìn)細(xì)胞增殖,改變細(xì)胞的趨化性,增加細(xì)胞的遷移從而加速創(chuàng)面愈合[29]。VEGFA 是作用較強(qiáng)的一種促血管生長(zhǎng)因子,是新生血管形成中心調(diào)控因子的有絲分裂原,其表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖具有重要作用[30]。胡春華等[31]通過對(duì)臨床患者組織微血管的觀測(cè),認(rèn)為VEGFA 參與了痔瘡的形成過程,抑制VEGFA的表達(dá)有利于痔瘡的恢復(fù)。槲皮素是脈絡(luò)舒通丸的一種有效成分,分子對(duì)接結(jié)果顯示,其與VEGFR 和EGFR 有較強(qiáng)的結(jié)合能力。王曉慶等[32]通過血管增生模型觀測(cè)槲皮素對(duì)于血管生成的影響,發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制VEGF 和堿性成纖維生長(zhǎng)因子所誘導(dǎo)的血管生成,同時(shí)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有抑制作用[33]。脈絡(luò)舒通丸可能是通過調(diào)節(jié)上述靶點(diǎn)來發(fā)揮治療痔瘡的作用。

GO 與KEGG 富集分析結(jié)果顯示,脈絡(luò)舒通丸有效成分調(diào)控的靶點(diǎn)集中在多種BP、CC 和MF 上,如細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、多細(xì)胞生物過程的調(diào)控、細(xì)胞對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)外部刺激的反應(yīng)、對(duì)含氧化合物的響應(yīng)、細(xì)胞增殖及對(duì)分子功能的正向調(diào)節(jié)等。脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡可能是作用于PI3K-Akt 信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、MAPK 信號(hào)通路、癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖、人類巨細(xì)胞病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染及乳腺癌等信號(hào)通路。這些通路與痔瘡的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。MAPK 信號(hào)通路主要調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)、細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞增殖和凋亡等,該通路的激活途徑相對(duì)保守[34-35]。

綜上所述,脈絡(luò)舒通丸可以通過調(diào)控炎癥反應(yīng)來治療痔瘡以及痔瘡術(shù)后創(chuàng)面的愈合。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探索了脈絡(luò)舒通丸治療痔瘡的作用機(jī)制并通過分子對(duì)接驗(yàn)證。在系統(tǒng)層面揭示了脈絡(luò)舒通丸可能是通過抑制炎癥反應(yīng)、提高免疫、促進(jìn)細(xì)胞增殖等多個(gè)分子機(jī)制來發(fā)揮治療痔瘡的作用。然而,本研究主要基于數(shù)據(jù)分析開展研究,因此需要進(jìn)一步的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證研究結(jié)果。