楊豐義，蘇 超，張海鵬，吳鶴松，王 鵬，李 偉，鐘佑宏

（1.云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理 671000；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206）

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的烈性傳染病，具有病死率高，傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)，主要經(jīng)鼠蚤傳播，屬廣泛流行于野生嚙齒動(dòng)物間的一種自然疫源性疾病[1]。鼠疫在世界范圍內(nèi)曾有過三次大流行，至少導(dǎo)致一億六千萬人死亡[2-5]，其中1772-1964年間發(fā)生的第三次大流行被認(rèn)為起源于云南[6]。云南省地處我國(guó)西南邊陲，與人間鼠疫淵源極久，早在公元1108年即有可疑人間鼠疫流行的記載[7]，近年來云南鼠疫仍較活躍，2016年發(fā)生人間病例[8]，因此鼠疫防控仍是云南重要的公共衛(wèi)生問題。

錫金小鼠屬于野生嚙齒動(dòng)物的一種，可攜帶著許多與人類疾病相關(guān)的病原體，鼠疫耶爾森菌便是其中的一種病原體[9]。1983年，就曾在兩份錫金小鼠材料中檢出鼠疫抗原陽性(云南省流研所資料匯編)，但錫金小鼠是否為云南鼠疫儲(chǔ)存宿主并可在家鼠和野鼠間傳播鼠疫尚不清楚。

1915-1917年英國(guó)的Edward和法國(guó)的D'Herelle最先報(bào)道鼠疫噬菌體，可用于進(jìn)行鼠疫病原體的鑒定[10-11]。國(guó)外的相關(guān)研究顯示鼠疫噬菌體廣泛存在于自然界[12]，且鼠疫噬菌體與鼠疫菌相互依存，分離到鼠疫噬菌體應(yīng)考慮到該材料中存在鼠疫菌或曾被鼠疫菌感染過。本研究在云南鼠疫疫源地中捕獲錫金小鼠，了解云南錫金小鼠是否攜帶有鼠疫噬菌體或鼠疫菌，為研究錫金小鼠在鼠疫傳播中的作用等方面提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑鼠疫菌疫苗株EV76，LB液體、半固體及固體培養(yǎng)基；腸道標(biāo)本DNA提取試劑盒、2×TaqPCR MasteMix購自天根生物科技（北京）有限公司；冷增菌液PEptone Sorbitol Bile Broth購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 調(diào)查地點(diǎn)2016-2017年，在云南家鼠鼠疫疫源地的3個(gè)調(diào)查點(diǎn)（宜良縣、梁河縣、文山市）進(jìn)行鼠疫宿主動(dòng)物調(diào)查。由于錫金小鼠活動(dòng)范圍廣，主要采用夾夜法，以自制油條為誘餌進(jìn)行捕獲并進(jìn)行屬種鑒定。

1.3 樣本采集對(duì)調(diào)查中捕獲經(jīng)鑒定后的錫金小鼠立即在生物安全柜中無菌條件下解剖，取2 cm左右腸道標(biāo)本，將其剪碎后放置于含有5 mL冷增菌液的15 mL離心管中，充分混勻后保存于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 鼠疫噬菌體的分離與純化將上述冷增菌液用0.22 μm濾膜過濾，以鼠疫疫苗株（EV76）為宿主菌，28℃下雙層平板法分離培養(yǎng)，18～24 h后觀察噬菌斑的生長(zhǎng)情況[13]。有噬菌斑的噬菌體菌株，單斑增殖4～6次提升效價(jià)及純度后[14]，可用于保存及噬菌體的電鏡觀察。

1.5 鼠疫噬菌體電鏡掃描取200 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EV76菌懸液加入至6 mL冷卻至45℃的LB半固體培養(yǎng)基中，輕微搖勻后傾倒LB薄層固體培養(yǎng)基。待雙層平板凝固后滴加10 μL待測(cè)噬菌體濾液（噬菌體效價(jià)至少達(dá)108PFU/mL），待噬菌體濾液吸收后正置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。16～20 h形成大噬菌斑，用接種環(huán)扣下有噬菌斑的上層半固體，浸泡于200 μL SM液中過夜，次日以5000 ×g離心5 min后取上清液，并用醋酸鈾染色（注意嚴(yán)格把控染色時(shí)間）制備電鏡標(biāo)本，透射電鏡下觀察鼠疫噬菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 鼠疫菌基因檢測(cè)按照TIANamp Genomic DNA KitDNA提取試劑盒要求，對(duì)鼠腸道標(biāo)本總DNA進(jìn)行提取。根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]對(duì)鼠疫菌的特異標(biāo)識(shí)基因caf1進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)鼠腸道標(biāo)本進(jìn)行鼠疫菌的初篩。引物序列如下：caf1/F：5'-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3'；caf1/R：5'-ACAGCATCAGTGTATTTACCTGCTG-3'。對(duì)于某些缺失pMT1質(zhì)粒的鼠疫菌株，可采用董珊珊等[16]建立的可同時(shí)檢測(cè)caf1及YPO0392基因的一體系雙重?zé)晒舛縋CR方法對(duì)鼠疫菌基因進(jìn)行檢測(cè)，避免漏檢。但目前研究中尚未發(fā)現(xiàn)云南鼠疫菌株有缺失pMT1的情況，所以此次研究采用檢測(cè)caf1基因的方法來進(jìn)行鼠疫菌的初篩。

1.7 宿主譜裂解實(shí)驗(yàn)本次實(shí)驗(yàn)選取24株腸道菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株（表3），采用點(diǎn)滴法測(cè)定錫金小鼠中分離的3株鼠疫噬菌體的裂解譜。分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，次日觀察結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理。

2 結(jié)果

2.1 錫金小鼠的捕獲情況在云南鼠疫疫源地3個(gè)調(diào)查點(diǎn)中共捕獲86只錫金小鼠，其中宜良縣29只、梁河縣11只、文山市46只。

2.2 鼠疫噬菌體分離結(jié)果86只錫金小鼠共分離出3株鼠疫噬菌體，分別在梁河縣分離到1株，分離率9.09%（1/11）；文山市分離到2株，分離率4.35%（2/46）；宜良縣未分離到鼠疫噬菌體（表2）。

表2 云南錫金小鼠中鼠疫噬菌體分離情況表Table 2 Y. pestis phages isolated from Mus pahari in Yunnan province

2.3 鼠疫噬菌體噬菌斑的生長(zhǎng)多樣性雙層平板法鋪板28℃孵育24 h后，通過肉眼觀察，3份鼠疫噬菌體的噬菌斑表現(xiàn)出生長(zhǎng)多樣性。其中LHS 274的噬菌斑表現(xiàn)為小噬斑（＜0.5 mm），28℃下噬菌斑非常模糊，在37℃下培養(yǎng)18～24 h后噬菌斑變得稍清晰；WSS 81的噬菌斑表現(xiàn)為中噬菌斑（直徑約1 mm），噬菌斑透亮；WSS 198的噬菌斑為特大噬菌斑（直徑＞3 mm），噬菌斑透明，邊界清晰（圖1）。

圖1 云南錫金小鼠腸道分離出的3株鼠疫噬菌體噬菌斑圖Fig.1 The plaques of 3 Yersinia pestis phages isolated from the intestine of Yunnan Mus pahari

2.4 鼠疫噬菌體電鏡下形態(tài)觀察對(duì)3株鼠疫噬菌體進(jìn)行電鏡掃描顯示，兩株均為較典型的肌尾型鼠疫噬菌體。其中LHS 274的頭部直徑約52 nm，尾部約118 nm；WSS 81的頭部直徑約70 nm，尾部約100 nm；WSS 198的頭部直徑約45 nm，尾部約135 nm。

圖2 電鏡下錫金小鼠腸道中分離出的3株鼠疫噬菌體形態(tài)（×100 000）Fig.2 Morphology of 3 Yersinia pestis phages isolated from the intestine of Mus pahari under electron microscope (×100 000)

2.5 鼠疫菌的特異標(biāo)識(shí)基因caf1檢測(cè)結(jié)果86只錫金小鼠脾臟、肝臟、腸道中特異標(biāo)識(shí)基因caf1進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果均為陰性。

2.6 3株鼠疫噬菌體宿主譜分析3株鼠疫噬菌體在28℃及37℃下除裂解EV76外，WSS 81還可裂解福氏1a、福氏2a、福氏3a、福氏X變種、索氏志賀、宋內(nèi)Ⅰ、宋內(nèi)Ⅱ、ATCC25922及ATCC35218；WSS 198還可裂解福氏Ⅹ變種及ATCC25922；LHS 274可裂解PSTⅠ、PSTⅣ、PSTⅤ、PSTⅥ，此外LHS 274在37℃溫度下還可裂解PSTⅡ（表3）。

表3 3株鼠疫噬菌體宿主譜結(jié)果Table 3 Results of host spectrum of 3 Yersinia pestis phages

3 討論

3.1 錫金小鼠與鼠疫的關(guān)系錫金小鼠（Mus pahari）屬于野棲小型鼠類，隸屬于鼠科中的小鼠屬。分布區(qū)域相對(duì)較廣，在我國(guó)首先于云南與緬甸接壤的南丁河被發(fā)現(xiàn)，云、貴、川等地均有分布[17]，在滇南山地、林區(qū)為優(yōu)勢(shì)種[18-19]。在梁河縣高（1880-1978 m）、中（1475-1490 m）、低（1068-1246 m）三個(gè)不同海拔地區(qū)均有分布，且在高海拔地區(qū)為優(yōu)勢(shì)種，跨帶分布能力強(qiáng)[20]。

1983年，在隴川縣景坎公社芒軟山區(qū)發(fā)生鼠間鼠疫，從該山區(qū)耕作地捕獲的錫金小鼠中檢出鼠疫抗原陽性（云南省流研所資料匯編）。根據(jù)文獻(xiàn)[21]分析總結(jié)，錫金小鼠可攜帶印鼠客蚤、特新蚤指名亞種、無孔微棒蚤直指亞種等鼠蚤。本次研究的3個(gè)調(diào)查點(diǎn)都為家鼠鼠疫疫源地，印鼠客蚤為其主要傳播媒介[22]。特新蚤指名亞種為云南野鼠鼠疫疫源地的主要傳播媒介；無孔微棒蚤直指亞種在云南省家鼠鼠疫疫源地?cái)?shù)量較多且分布廣，1991年還從兩匹無孔微棒蚤直指亞種中分離出鼠疫菌[23]。蚤類既是鼠疫菌的儲(chǔ)存宿主，又是傳播媒介，在鼠疫流行傳播中承擔(dān)重要角色。鼠類作為鼠蚤的寄主，錫金小鼠通過鼠疫菌的鼠-蚤-鼠傳播，可能會(huì)在家-野型鼠疫疫源地傳播中發(fā)揮作用。

3.2 云南錫金小鼠中存在鼠疫噬菌體此次噬菌體分離實(shí)驗(yàn)共從86只錫金小鼠中成功分離出3株鼠疫噬菌體，分離率為3.49%，證明錫金小鼠中存在一定量的鼠疫噬菌體。從分離率上看，錫金小鼠中鼠疫噬菌體分離率低于玉龍野鼠鼠疫疫源地中儲(chǔ)存宿主齊氏姬鼠的分離率（10.85%），高于流行宿主大絨鼠的分離率（2.60%）[13]；而與鶴慶野鼠鼠疫疫源地及劍川野鼠鼠疫疫源地相比，其分離率均高于主要宿主齊氏姬鼠（鶴慶3.45%，劍川2.40%）及大絨鼠（鶴慶為0%和劍川0.42%）[14,24]。錫金小鼠中分離出鼠疫噬菌體，不排除其感染過鼠疫菌的可能性，如果是這樣，在感染后又康復(fù)，那么錫金小鼠在鼠疫流行中就可充當(dāng)儲(chǔ)存宿主及鼠疫的流行宿主，由此錫金小鼠在鼠疫流行中就具有較大的流行病學(xué)意義，值得進(jìn)一步關(guān)注。

3.3 3株鼠疫噬菌體具有寬宿主譜3株鼠疫噬菌體除在28℃及37℃下均裂解鼠疫疫苗株EV76外，還可裂解非鼠疫菌株。與鐘佑宏等[25]研究的LJ-7的宿主譜（除鼠疫菌外，只裂解福氏志賀菌）相比，3株鼠疫噬菌體除裂解EV76外，WSS81及WSS198還可裂解大腸桿菌、志賀菌屬，LHS274還可裂解5株假結(jié)核耶爾森菌，宿主譜范圍更廣。從微生態(tài)學(xué)方面來說，當(dāng)鼠疫噬菌體有除鼠疫菌外的其他宿主菌存在時(shí)，鼠疫噬菌體可以不依賴鼠疫菌生長(zhǎng)繁殖。那么針對(duì)此次有鼠疫噬菌體存在，但未檢出鼠疫菌，一方面可能就是由于這3株噬菌體依賴于其他宿主菌生存；另一方面這是否與噬菌體存活時(shí)間長(zhǎng)及二者之間存在協(xié)同共生又此消彼長(zhǎng)有關(guān)，噬菌體的種群擴(kuò)大抑制了鼠疫菌的生長(zhǎng)。由此具有寬宿主譜的鼠疫噬菌體可能會(huì)在動(dòng)物間鼠疫中起到一個(gè)調(diào)節(jié)作用，這對(duì)以后將微生態(tài)學(xué)應(yīng)用于鼠疫防治有重要意義。

3.4 噬菌體多態(tài)性此次分離的3株鼠疫噬菌體，從噬菌斑大小及狀態(tài)來看，有3種形態(tài)，LHS274表現(xiàn)為針尖樣大小的小噬菌斑；WSS81表現(xiàn)為直徑約1 mm的中噬菌斑，噬菌斑形態(tài)較LHS274好；WSS198表現(xiàn)為直徑＞3 mm的特大噬菌斑，噬菌斑透亮。以上鼠疫噬菌體與玉龍，鶴慶及劍川所分離到的鼠疫噬菌體相比較[13-14,24]，LHS274噬菌斑大小及狀態(tài)除與玉龍野鼠鼠疫疫源地中齊氏姬鼠中分離到的LJ 123及大絨鼠中分離到的LJ218噬菌斑相似，與上述三處鼠中分離所得的其他鼠疫噬菌體均有差異。WSS 81與鶴慶疫源地中分離的鼠疫噬菌體HQ1、HQ2噬菌斑大小相似，但噬菌斑更為透亮，與其他幾株鼠疫噬菌體無相似性。WSS198與以上三個(gè)野鼠鼠疫疫源地鼠種中分離的噬菌體對(duì)比，噬菌斑均較大。不論是此次分離的3株噬菌體比較或是與相關(guān)文獻(xiàn)已分離的比較，噬菌斑均具有多態(tài)性，加之宿主譜有差異，由此推斷噬菌體具有多態(tài)性，有待進(jìn)一步深入研究。