喬連江，張 萍，周玉成，楊 森，楊艷玲

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130000）

布魯菌?。ê喎Q“布病”）是由布魯菌屬（Brucellaspp.）引起的一種嚴重人畜共患傳染病，被列為我國法定傳染病中乙類傳染病之首[1]。該菌為一種典型的胞內(nèi)寄生菌，其主要寄生于宿主的單核巨噬細胞中，可引起動物和人持續(xù)性感染[2]。近年來，隨著我國畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，動物布病發(fā)病率極速攀升，并且人間布病的感染率也達到了歷史新高[3]，嚴重影響了我國畜牧業(yè)健康發(fā)展，也給公共衛(wèi)生安全帶來了重大隱患。

在布魯菌（Brucella）諸多毒力因子中，由virB操縱子所編碼Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）是一種關鍵毒力因子[4]。該系統(tǒng)可跨越細胞膜建立一個轉運通道，通過一個類似鞭毛樣結構與靶細胞接和，使分泌的效應蛋白到達靶細胞，從而幫助布魯菌快速適應胞內(nèi)環(huán)境并得以存活。據(jù)報道[5]，現(xiàn)已鑒定出布魯菌T4SS效應蛋白約15種，初步證實了這些效應蛋白被分泌到宿主細胞后，在調(diào)控布魯菌胞內(nèi)生存、復制方面發(fā)揮著重要作用。其中，BtpA和BtpB作為重要的分泌效應蛋白，在布魯菌感染早期可抑制免疫監(jiān)視系統(tǒng)、干擾細胞的功能[6]。但是，對于BtpA和BtpB是如何精巧的調(diào)節(jié)宿主免疫反應的機制還不清楚。為此，本研究以布魯菌16M基因組為模板，成功構建了布魯菌BtpA和BtpB基因缺失重組載體。同時，利用分子生物信息學軟件對BtpA和BtpB基因的種屬間同源性、信號肽、二級結構以及B細胞表位進行預測，為下一步研制布魯菌診斷試劑和疫苗奠定數(shù)據(jù)基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器羊布魯菌16M（Brucella melitensis16M）為軍事獸醫(yī)研究所保藏惠贈；大腸埃希菌E. coliDH5α感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司；自殺質(zhì)粒PBK-CMV-SacB由軍事獸醫(yī)研究所惠贈；TSA和TSB培養(yǎng)基購自SIGMA公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase和2×In-Fusion HD Cloning Kit購自TaKaRa公司；DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司；硫酸卡那霉素（Kan）購自上海生工生物工程（上海）科技有限公司；限制性內(nèi)切酶SmaⅠ購自NEB公司。PCR基因擴增儀及凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；微量分光光度儀購自Bio-Tek公司；電泳槽設備購自北京六一電泳設備有限公司；搖床購自上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.2 PCR引物的設計及合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的羊布魯菌16MBtpA和BtpB基因序列，自殺質(zhì)粒PBKCMV-SacB的載體特征及所含酶切位點信息。此外，引物還應滿足自殺載體末端序列與融合片段二端具有15 bp的同源堿基。使用Primer Premier 6.0設計引物（小寫部分為相鄰片段的同源序列），并送長春市庫美生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 BtpA和BtpB基因上、下游同源臂的克隆以羊布魯菌16M基因組DNA為模板，分別使用引物BtpAf-F/ BtpAf-R和BtpAr-F/ BtpAr-R、BtpBf-F/BtpBf-R和BtpBr-F/ BtpBr-R進行PCR擴增。PCR反應體系（50 μL）：5×PrimerSTAR Buffer 10 μL，dNTP MIX 4 μL，PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O補全。擴增程序：98℃預變性6 min；98℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收后，送長春市庫美生物有限公司進行測序分析。

1.6 自殺質(zhì)粒PBK-CMV-SacB線性化于-80℃冰箱取出保存的自殺質(zhì)粒PBK-CMV-SacB，經(jīng)SmaⅠ單酶切消化后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.7 采用無縫克隆技術，構建重組載體以分光光度法測定待融合片段和線性載體的濃度，按照TaKaRa公司無縫克隆重組酶（In-Fusion Cloning）說明書設計反應體系，載體與各插入的片段的最佳摩爾比為1∶2，分別構建了BtpA和BtpB重組自殺載體。將該連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，按TaKaRa公司質(zhì)粒載體轉化方法進行操作。取150 μL轉化產(chǎn)物，均勻涂布于含卡那（Kan）抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)10～12 h，挑取單菌落進行PCR鑒定，并將陽性產(chǎn)物測序鑒定。此外，對陽性產(chǎn)物進行SacB基因的PCR檢測。將驗證正確的產(chǎn)物分別命名為PBK-CMV-SacB-ΔBtpA和PBK-CMV-SacBΔBtpB，于-80℃保存，并使用DANMAN軟件繪制構建重組載體的簡圖（圖1，圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒PBK-CMV-SacB-ΔBtpAFig.1 Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpA

圖2 重組質(zhì)粒PBK-CMV-SacB-ΔBtpBFig.2 Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpB

1.8 BtpA和BtpB基因的分子生物學預測利用分子生物學軟件DNAStar、SignaIP-4.1Server和NCBI網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫等，對羊布魯菌效應蛋白BtpA和BtpB進行了基因序列同源性，信號肽、二級結構以及抗原表位的深入分析。

2 結果

2.1 BtpA和BtpB上、下游同源臂的PCR擴增以羊布魯菌16M基因組為模板，利用上、下游同源臂引物分別獲得了BtpA上、下游同源臂片段（835 bp）和BtpB上、下游同源臂片段（824 bp）。其測序結果顯示未出現(xiàn)堿基突變，堿基序列與模板完全一致（圖3，圖4）。

圖3 上游同源臂BtpAf和下游同源臂BtpAr的PCR結果Fig.3 The electrophoresis result of PCR product of upstream homology arm BtpAf and downsteam homology arm BtpAr

圖4 上游同源臂BtpBf和下游同源臂BtpBr的PCR結果Fig.4 The electrophoresis result of PCR product of upstream homology arm BtpBf and downsteam homology arm BtpBr

2.2 自殺質(zhì)粒PBK-CMV-SacB酶切鑒定對自殺質(zhì)粒PBK-CMV-SacB進行單酶切鑒定，PCR結果顯示，單酶切后質(zhì)粒上移，與預期大小相符，說明自殺質(zhì)粒酶切成功（圖5）。

圖5 自殺質(zhì)粒PBK-CMV-SacB酶切鑒定結果Fig.5 Restriction map of Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB

2.3 重組載體鑒定將轉化產(chǎn)物，用特異性引物進行PCR鑒定，結果顯示：BtpA上、下游同源臂片段和BtpB上、下游同源臂片段分別插入了載體（圖6，圖7）。重組質(zhì)粒的測序結果也驗證了待融合片段成功整合到了自殺質(zhì)粒PBK-CMV-SacB上。此外，對驗證正確的產(chǎn)物進行了SacB基因的檢測，得到了1600 bp的條帶（圖8）。

圖6 重組載體PBK-CMV-SacB-ΔBtpA的PCR鑒定Fig.6 The electrophoresis result of PCR product of Recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpA

圖7 重組載體PBK-CMV-SacB-ΔBtpB的PCR鑒定Fig.7 The electrophoresis result of PCR product of recombinant plasmid PBK-CMV-SacB-ΔBtpB

圖8 重組載體SacB基因的PCR鑒定Fig.8 The electrophoresis result of PCR product of recombinant plasmid SacB gene

2.4 BtpA和BtpB分子生物信息學方法的預測

2.4.1BtpA和BtpB基因序列分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫上，搜索布魯菌不同種屬、不同生物型的BtpA和BtpB基因序列，經(jīng)線上BLAST軟件比對分析后，發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性均在99%以上。表明了BtpA和BtpB基因在布魯菌中差異性極小、高度保守。

2.4.2 BtpA和BtpB信號肽及其切割位點的預測 在NCBI線上數(shù)據(jù)庫下載羊布魯菌BtpA和BtpB的氨基酸序列。并利用線上軟件SignaIP-4.1Server對BtpA和BtpB氨基酸序列的信號肽及其切割位點進行預測。軟件通過計算分析得到效應蛋白BtpA和BtpB均不具有信號肽，分別在21和60位氨基酸處存在切割位點（圖9，圖10）。

圖9 BtpA 信號肽預測Fig.9 Signal peptide predictionof BtpA protein

圖10 BtpB信號肽預測Fig.10 Signal peptide predictionof BtpB protein

2.4.3 BtpA和BtpB二級結構的預測 將BtpA和BtpB氨基酸序列導入DNAStar軟件包中protean，按照Garnier-Robson Chou-Fasman 及Karplus-Schulz方法進行二級結構的解析預測。結果可知，效應蛋白BtpA和BtpB均具有α-螺旋、β-折疊及無規(guī)則卷曲等豐富的二級結構。同時分析到柔性結構區(qū)域在BtpA N-端的5-14、18-41、44-65、69-75、79-88、92-118、124-134、139-143、151-157、167-169、182-198、210-212、216-220、226-231、242-254、259-265處，而在BtpB N-端的8-14、31-46、52-55、65-69、77-82、123-131、134-138、139-147、163-170、182-183、189-192、198-206、211-214、222-230、245-248、255-259、265-269、274-279處，在柔性結構區(qū)域易于形成抗原表位（圖11，圖12）。

圖11 按Garnier-Robson Chou-Fasman法預測BtpA和BtpB蛋白的α-螺旋和β-折疊區(qū)域Fig.11 Alpha helix and beta fold regions of BtpA and BtpB protein predicted by the methods of Garnier-Robson and Chou-Fasman

圖12 按Garnier-Robson chou-Fasman及Karplus-Schulz法預測BtpA和BtpB蛋白的二級結構柔性片段Fig.12 Flexible regions prediction of secondary structure of BtpA and BtpB protein by the methods of Garnier-Robson Chou-Fasman and Karplus-Schulz

2.4.4 BtpA和BtpB B細胞抗原表位的預測 按照算法Kyte-Doolittle、Emoni及Jameson-Wolf分別對蛋白的親水性、表面可及性和抗原性進行了預測，結果如圖13所示。對B細胞抗原表位的預測，需將蛋白的二級結構柔性區(qū)域、親水性、表面可及性和抗原性作綜合分析。結果顯示，極有可能是B細胞抗原表位的分別是BtpA N-端5-13、18-40、49-65、79-88、92-101、139-143、151-157處，以及BtpB N-端8-14、31-39、189-192、223-230、246-250處。

圖13 BtpA和BtpB蛋白親水性、表面可及性和抗原性的預測Fig.13 Analysis of hydrophilicity、surface probability plot and antigenic index of BtpA and BtpB protein

3 討論

布病作為一種重要的人畜共患傳染病，對其毒力因子的研究一直是布魯菌病原免疫學的重要內(nèi)容之一。BtpA和BtpB作為布魯菌分泌的一種具有Toll受體結構域的毒力因子，一旦進入宿主細胞，就會與MyD88相互作用，進而干擾TLR信號傳導并調(diào)節(jié)微管動力學[7-8]。在大腸桿菌、腸沙門菌、鼠疫耶爾森氏菌等病原微生物中，均發(fā)現(xiàn)了含TLR結構域的毒力蛋白[9]。Felix等[10]通過建立BtpA和BtpB真核表達載體，發(fā)現(xiàn)了BtpA和BtpB可調(diào)控胞內(nèi)ATP和NAD分子水平，破壞宿主細胞的能量代謝，為解釋布魯菌的生存機制提供了新的思路。但是，目前對于BtpA和BtpB如何調(diào)控宿主的信號通路還存在爭議[11-12]?；蛉笔Ъ夹g作為研究病原菌致病機制的基本手段之一，在研究毒力因子功能中被大量使用。本試驗通過利用無縫克隆技術（in-fusion），成功構建了無痕基因缺失突變載體。該技術與經(jīng)典的克隆方式不同[13-16]，其設計引物時，需要線性載體末端和待融合片段具有15-20個相同堿基。依靠堿基間的作用力實現(xiàn)同源重組，無需連接酶即可成環(huán)狀，直接用于轉化宿主菌[17]。極大簡化了構建載體的步驟，并可一次性進行多片段的連接，降低了成本，提高了效率。為以后基因敲除提供了新的思路。

此外，經(jīng)分子生物信息學軟件對BtpA和BtpB功能進行預測。發(fā)現(xiàn)BtpA和BtpB序列高度保守，不同種屬之間僅有個別核苷酸的差異，說明了BtpA和BtpB可能對布魯菌生命活動是必要的。BtpA和BtpB蛋白均無信號肽，表明其可能屬于非分泌型蛋白，需要借助非經(jīng)典途徑進入宿主細胞發(fā)揮調(diào)控作用。效應蛋白BtpA和BtpB為α-螺旋為主的二級結構，擁有一定量的B細胞抗原表位，可作為鑒別診斷試劑和亞單位疫苗的候選基因。但具體的分子生物學功能需要進一步通過試驗驗證。

本研究通過構建BtpA和BtpB無痕缺失突變載體，并利用生物信息軟件對其功能進行了預測，為進一步解析布魯菌的致病機制提供了工具和信息數(shù)據(jù)支持。