張家莉，段世宇，令狐遠鳳，潘 永，楊 琦,3

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州大學動物疫病研究所，貴陽 550025；3.貴州省動物疫病研究室，貴陽 550025；4.貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550025）

沙門菌（Salmonella）是全世界最常見的引起人畜共患病的病原之一[1]，對我國的畜禽養(yǎng)殖行業(yè)造成了嚴重的威脅，其主要通過食源性傳播，在多個國家都可以引起嚴重危害[2]。鼠傷寒沙門菌是沙門菌的一個重要血清型，是目前分離率最高的菌型之一[3]，也是研究最多的細菌病原體之一，由于其生長條件簡單，易培養(yǎng)，因此常用作研究胃腸道感染發(fā)病機制的模型[4]。

革蘭氏陰性菌含有雙層膜，最外層的外膜含有大量的外膜蛋白，且具有包括營養(yǎng)吸收、細胞粘附、細胞信號傳遞和廢物輸出等重要的功能。對于致病菌，許多外膜蛋白也作為毒力因子清除營養(yǎng)物質(zhì)和規(guī)避宿主的防御機制[5]。OmpA是革蘭氏陰性菌的主要外膜蛋白，同時也是腸桿菌外膜中的主要抗原[6]，可作為大腸桿菌的侵襲素[7]，對入侵腦微血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）至關重要，還可介導部分腸桿菌粘附受體細胞[8]，可作為一種免疫逃逸蛋白避免宿主防御，包括干擾補體激活、抑制細胞因子誘導等[9]，同時也參與細菌生物被膜的形成[10]。關于ompA基因?qū)κ髠抽T菌的生物學特性的影響還未見報道，為進一步了解ompA基因的作用以及對毒力的影響，本研究利用λ-Red同源重組系統(tǒng)敲除ompA基因，研究其生物學特性，為進一步研究外膜蛋白基因ompA的生物學功能及沙門菌致病性奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒以及主要試劑野生型鼠傷寒沙門菌STM LT2，質(zhì)粒pKD13、STM 7455株（含有質(zhì)粒pKD46）、質(zhì)粒pCP21（pKD 46與pCP21均為溫敏質(zhì)粒，37℃時消失）均由CNRS分子遺傳學Bossi實驗室饋贈。

細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，L-阿拉伯糖購自貴州卓一生物科技有限公司，GreenTaqMix、瓊脂糖DNA回收試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 ompA基因缺失株的構(gòu)建

1.2.1 引物設計 根據(jù)NCBI查尋的鼠傷寒沙門菌的全基因組序列（GenBank登錄號：AE006468.2）設計引物（表1），P1/P2目的是為擴增打靶片段，下劃線序列與ompA基因為同源序列，未加下劃線序列為質(zhì)粒pKD13的kan序列同源。P3/P4為檢測kan基因是否成功將ompA基因替換，P5/P6用于檢測kan基因是否成功缺失。引物送往生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 構(gòu)建基因缺失株所用引物Table 1 Primers used to construct gene deletion strains

1.2.2 打靶片段的制備 以質(zhì)粒pKD13為模板，以P1/P2為引物進行Touchdown PCR擴增。反應體系為50 μL，反應體系為：pKD13模板（10 mg/L）8 μL，P1/P2引物各2 μL，ddH2O 13 μL，GreenTaqMix 25 μL。反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，55℃復性30 s，72℃延伸1.5 min，共循環(huán)5次；95℃預變性10 s，54℃復性30 s，72℃延伸1.5 min，共循環(huán)5次；95℃預變性10 s，52℃復性30 s，72℃延伸1.5 min，共循環(huán)15次；72℃再延伸8 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產(chǎn)物純化后進行下一步操作。

1.2.3 STM LT2ΔompA的構(gòu)建 感受態(tài)細胞的制備：挑取STM 7455菌株單菌落接種于5 mL LB中37℃振蕩過夜培養(yǎng)，次日1∶100復接與70 mL LB中，加入52 μL 20%的阿拉伯糖，30℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)早期（OD600=0.2～0.3），用10%甘油洗滌4次后重懸與200 μL的甘油中，每管分裝50 μL并置于冰上備用。

一次重組菌株的構(gòu)建：將已經(jīng)純化好的打靶片段按1∶10的比例與感受態(tài)細胞混合后進行電轉(zhuǎn)，37℃孵育1 h后取200 μL涂布于Kan抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)，次日挑取陽性轉(zhuǎn)化子，利用引物P3/P4進行鑒定。構(gòu)建成功的基因命名為：STM LT2ΔompA::kn。

二次重組菌株的構(gòu)建：取1 μL pCP21質(zhì)粒與50 μL STM LT2ΔompA::kn感受態(tài)細胞混合后電轉(zhuǎn)，目的是去除STM LT2ΔompA::kn中的Kan抗性基因，30℃孵育1 h后涂布于Amp抗性平板，30℃過夜培養(yǎng)后挑取單個菌落以P5/P6進行驗證，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序鑒定。最終獲得STM LT2ΔompA。

1.3 生長特性的檢測分別將STM LT2與STM LT2ΔompA按1∶100接種于LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)接至20 mL新鮮LB中，調(diào)節(jié)初始OD600=0.01，37℃、170 rpm振蕩培養(yǎng)，每隔1 h分別取樣測定OD600的值，共測15次，每株重復3次取平均值并繪制生長曲線圖。

1.4 運動能力的測定取過夜培養(yǎng)的菌株按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到5 m L新鮮L B中，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8～0.9，取2 μL滴加到0.3%瓊脂平板中央，37℃正置培養(yǎng)8 h后測量細菌運動圈直徑，重復3次取平均值。

1.5 生化特性的測定分別挑取STM LT2、STM LT2ΔompA單個菌落接種于：尿素梅、賴氨酸脫羧酶、葡萄糖、乳糖、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、蔗糖、硫化氫、蛋白胨水（靛基質(zhì)實驗）、半固體瓊脂、V-P等生化管鑒定，37℃靜置培養(yǎng)24或48 h，觀察并記錄實驗結(jié)果。重復3次。

1.6 生物被膜形成的測定將過夜培養(yǎng)的菌株按1∶100接種于YP生物膜誘導培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 2.5g/L、KH2PO43 g/L、K2HPO47 g/L、(NH4)2SO42 g/L、FeSO40.5 mg/L、MgSO41 g/L、鹽酸硫胺素VB12 g/L)，在96孔板中加入150 μL菌液，每個菌做8個重復，37℃靜置培養(yǎng)48 h，取出菌液后蒸餾水洗3次，甲醛固定20 min，蒸餾水洗3次，2%結(jié)晶紫染色20 min，蒸餾水洗滌后溶解于無水乙醇中，測量吸光度OD575值。

1.7 耐藥性檢測參照CLSI試驗標準，利用K-B紙片法對STM LT2與STM LT2ΔompA進行藥物敏感性檢測。將各株分別接種于5 mL LB中，37℃過夜培養(yǎng)。次日收集菌體，用無菌PBS調(diào)節(jié)細菌濃度為0.5個麥氏比濁度，取100 μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基，貼藥敏片，37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，重復3次。

1.8 對Caco-2細胞粘附性檢測細菌計數(shù)：將復蘇后的STM LT2與STM LT2ΔompA培養(yǎng)至OD600為0.6左右，用無菌PBS反復清洗3次后重懸細菌沉淀，10倍梯度稀釋后取20 μL進行平板細菌計數(shù)，做3個重復。

粘附性試驗：利用臺盼藍細胞計數(shù)法將狀態(tài)良好的Caco-2細胞進行細胞計數(shù)（臺盼藍：細胞=1∶1），將細胞平鋪于24孔細胞板中過夜培養(yǎng)，次日，將計數(shù)的STM LT2與STM LT2ΔompA用無抗10%MEM重懸，并設置感染細胞的MOI=100，做3個重復。37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，無菌PBS把未粘附細胞的細菌洗掉，每孔加1 mL 1%Trition X-100，37℃作用10～15 min 裂解細胞，將裂解產(chǎn)物10倍梯度稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基中37℃放置過夜，每個梯度涂3個板，次日進行細菌計數(shù)取平均值，比較各菌株的粘附能力。粘附率=（粘附細胞菌數(shù)/孔內(nèi)感染菌數(shù)）×100%。

侵襲力試驗：感染步驟同粘附性試驗，PBS洗滌后加入10% FPS和100 μg/mL慶大的MEM培養(yǎng)基，殺死胞外細菌，侵襲1 h后無菌PBS洗滌3次，將裂解液與無菌PBS（體積比1∶9）混勻后倍比稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，次日進行細菌計數(shù)，比較各菌株的侵襲力力。侵襲率=侵入細胞細菌數(shù)/孔內(nèi)感染菌數(shù)×100%。

1.9 半數(shù)致死量(LD50)的測定取STM LT2與STM LT2ΔompA過夜菌液，1∶100接種于5 mL新鮮LB中37℃、170 rpm培養(yǎng)至對數(shù)期，將全部菌液轉(zhuǎn)移至離心管，8000 ×g離心5 min收集菌體，無菌PBS洗滌2次后加入等體積PBS重懸細菌，進行10倍梯度依次稀釋后進行細菌滴板計數(shù)。選取28只雌、雄各半KM小鼠隨機分為7組，每組4只，其中3組接種鼠傷寒沙門菌野生型STM LT2菌株，另3組為STM LT2ΔompA株，最后一組為空白對照組。分別按照1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL的濃度進行腹腔注射，對照組接種等劑量無菌PBS。接種后正常飼喂，每隔12 h記錄小鼠死亡情況，連續(xù)觀察7 d，采用寇式改良法計算LD50。

2 結(jié)果

2.1 ompA基因缺失株的構(gòu)建結(jié)果鼠傷寒沙門菌STM LT2ΔompA菌株的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，打靶片段可獲得1377 bp片段，第一次重組菌株（STM LT2ΔompA::kn）和二次重組菌株（STM LT2ΔompA）擴增的片段大小分別為519 bp和350 bp（圖1）。經(jīng)測序鑒定后的結(jié)果表明，ompA已被成功敲除。

圖1 ompA基因缺失株的構(gòu)建結(jié)果Fig.1 Construction result of ompA gene deletion strain

2.2 生長曲線的繪制利用GraphPad prisim 8.0將STM LT2和STM LT2△ompA的在普通液體LB下生長15 h的生長情況繪制成生長曲線。結(jié)果如圖所示（圖2），兩種菌株生長速度無明顯差異，均在第6 h左右達到對數(shù)生長期。此研究表明ompA基因缺失不會影響鼠傷寒沙門菌的生長速率。

圖2 生長曲線的繪制結(jié)果Fig.2 Drawing results of growth curve

2.3 運動性檢測37℃溫箱正置培養(yǎng)8 h測量其運動性，結(jié)果顯示（圖3），STM LT2和STM LT2△ompA菌在半固體瓊脂平板上所形成的菌環(huán)直徑基本一致。說明ompA基因缺失不影響鼠傷寒沙門菌的運動性。

圖3 運動性檢測結(jié)果Fig.3 Test results of mobility

2.4 生化特性檢測結(jié)果經(jīng)生化培養(yǎng)24～48 h，結(jié)果顯示：STM LT2和STM LT2△ompA菌均具有運動性，能發(fā)酵衛(wèi)矛醇、硫化氫，能分解賴氨酸、葡萄糖，蛋白胨水（靛基質(zhì)實驗）為陽性，均不能分解蔗糖、尿素酶、乳糖、麥芽糖，V-P試驗均為陰性（見表2）。說明ompA基因的缺失不影響細菌的生化特性。

表2 生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results

2.5 生物被膜檢測結(jié)果利用96孔板對STM LT2和STM LT2△ompA的生物被膜進行定量檢測，比較OD575的數(shù)值。結(jié)果顯示，野生型STM LT2的OD575平均值約為0.85，STM LT2△ompA的OD575平均值約為0.51。缺失株生物被膜形成能力明顯下降（P＜0.001），說明ompA基因能夠影響STM LT2的生物被膜形成。

圖4 生物被膜檢測結(jié)果Fig.4 Test results of biofilm

2.6 耐藥性檢測結(jié)果利用K-B紙片法對標準株以及ompA基因缺失株進行耐藥性分析，結(jié)果顯示（表3），相較于STM LT2，ompA基因缺失株對除新霉素外的各藥敏片的抑菌圈明顯增大，說明ompA基因的缺失會增加鼠傷寒沙門菌對多種抗生素的敏感性。同時，本研究發(fā)現(xiàn)ompA基因缺失后，多粘菌素B的敏感性明顯增強，表明ompA可能參與鼠傷寒沙門菌感染中應對體內(nèi)抗菌肽的殺傷。

表3 藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity test

2.7 粘附性與侵襲力試驗結(jié)果分別測定親本株和ompA缺失株對Caco-2細胞的粘附能力與侵襲力，結(jié)果如圖5、6所示：與野生型鼠傷寒沙門菌STM LT2相比，ompA缺失株對Caco-2細胞的粘附能力與侵襲力菌明顯下降，均下降約79%，且差異極顯著（P＜0.001）。因此，ompA基因的缺失可降低鼠傷寒沙門菌的粘附性及侵襲力。

圖5 粘附性試驗結(jié)果Fig.5 Adhesion Results

圖6 侵襲力試驗結(jié)果Fig.6 Invasive Results

2.8 半數(shù)致死量（LD50）的測定結(jié)果攻毒后，每隔12 h觀察一次小鼠狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)各實驗組小鼠在24 h后出現(xiàn)食欲下降，被毛粗亂、扎堆，反應遲緩，個別小鼠出現(xiàn)雙眼或單眼失明等癥狀，其中STM LT2菌株1×107CFU/mL組小鼠在48 h內(nèi)全部死亡。利用改良寇氏法計算LD50，lgLD50=Xk- n (ΣP-0.5)，其中Xk為最大劑量對數(shù)，P為各組的死亡率，n為相鄰兩組對數(shù)劑量之差，ΣP為各組小鼠死亡率之和。各實驗組小鼠死亡情況及LD50如下（表4）。結(jié)果顯示ompA缺失后，半數(shù)致死量為5.2×106CFU，至少是野生型菌株的半數(shù)致死量的5倍。以上結(jié)果說明，ompA缺失后，可使沙門菌的毒力下降。

表4 STM LT2與STM LT2△ompA的小鼠死亡數(shù)與LD50測定結(jié)果Table 4 The number of mouse deaths and LD50 determination results ofSTM LT2 andSTM LT2△ompA

3 討論

沙門菌是全世界最常見的引起人畜共患病的病原之一，具有重要的研究價值，其疫苗的研究正不斷成熟，其中基因工程減毒苗是人們主要關注的重點[11]?；谑删w的λ-Red同源重組系統(tǒng)能夠?qū)μ囟―NA序列進行增添、缺失或者替換，這種方法利用噬菌體重組蛋白來介導細胞中的同源重組，通過向表達噬菌體重組蛋白的細胞中引入具有短同源側(cè)翼DNA序列的選擇性標記，就可以很容易地獲得位點特異性染色體基因敲除[12]，且大片段基因缺失后不易發(fā)生基因突變，為減毒活疫苗株的安全性奠定了基礎，目前正在成為染色體基因工程的一種通用和替代方法[13]。

本研究基于λ-Red同源重組技術成功構(gòu)建出鼠傷寒沙門菌ompA基因缺失株，通過測量生長曲線、運動性、生化特性發(fā)現(xiàn)與標準株STM LT2并無明顯區(qū)別。細菌生物被膜是附著在細胞表面或者是以聚集體的形式包裹在細胞外基質(zhì)的微生物群落，可以增強細菌對外界惡劣環(huán)境的耐受性，同時參與細菌的耐藥性[14]，是影響細菌的毒力的關鍵因素之一[15]。生物被膜檢測發(fā)現(xiàn)，ompA的缺失導致鼠傷寒鼠傷寒沙門菌的生物被膜形成能力下降，表明ompA參與細菌生物被膜的形成。由于生物被膜減少，ompA基因缺失株對多種抗生素的敏感性明顯增強，同時，本研究發(fā)現(xiàn)ompA缺失后對多黏菌素B的敏感性增強，多黏菌素B是多肽類抗生素，可作用于沙門菌外膜脂多糖使細菌死亡，其殺菌機制與宿主免疫系統(tǒng)分泌的抗菌肽相似，因此，多黏菌素B常用作某些細菌的抑制劑[16]，此結(jié)果表明ompA可能參與細菌抗菌肽的抑制。粘附性是病原微生物入侵機體的關鍵引物，有研究表明，ompA可作為一些細菌的黏附素[17]，也可介導細菌侵襲骨髓間質(zhì)干細胞[18]，同時幫助細菌逃避宿主的免疫抑制機制[19]；本結(jié)果顯示，ompA缺失后菌株對Caco-2細胞的粘附能力以及侵襲力明顯下降，推測其原因可能是由于生物被膜的降低導致細菌的抗逆性及致病性降低，或者對細胞的粘附性降低而導致細菌毒力的下降。由此可見，ompA的缺失可顯著降低細菌的毒力。

本研究探索了ompA基因?qū)κ髠抽T菌的生長特性、運動性、生物被膜形成能力、生化特性、耐藥性以及對細胞的粘附性和侵襲力的影響，并進行動物回歸試驗探究了缺失株對小鼠半數(shù)致死量的影響。結(jié)果表明，ompA會影響細菌的耐藥性，生物被膜形成能力細胞粘附性、侵襲力及毒力。本研究為進一步研究外膜蛋白基因ompA基因的生物學功能及沙門菌致病性奠定了理論基礎。