吳 瓊，孫英杰，丁 鏟，廖 瑛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

一些病毒感染真核細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞迅速終止蛋白翻譯，在細(xì)胞質(zhì)中形成的致密顆粒狀聚合體，即應(yīng)激顆粒（Stress granule, SG）[1]。RNA病毒主要通過(guò)復(fù)制過(guò)程中的中間產(chǎn)物雙鏈RNA，激活PKR，磷酸化eIF2α，使蛋白翻譯起始所需的三元復(fù)合物eIF2-GTP-Met-tRNAMet不能循環(huán)利用，蛋白翻譯停滯[2]，多聚核糖體解離，mRNA和翻譯相關(guān)元件在細(xì)胞質(zhì)中與G3BP1（Ras GTPase-activating protein binding protein 1）和TIA1（T cell restricted intracellularantigen-1）等核心蛋白聚集形成SG。

已有報(bào)道表明，SG能夠招募RNA感受器RIG-I和PKR，啟動(dòng)干擾素信號(hào)通路，促進(jìn)抗病毒天然免疫應(yīng)答[3]。因此，許多病毒感染進(jìn)化出抑制SG的機(jī)制，抵御其抗病毒作用[4-5]。例如：Theiler氏鼠科腦脊髓炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus,TMEV）在感染細(xì)胞時(shí)，病毒非結(jié)構(gòu)蛋白L抑制SGs的形成[6]。麻疹病毒（Measles virus, MV）在感染細(xì)胞后，細(xì)胞中不產(chǎn)生SG；與野生型毒株相比，麻疹病毒C蛋白缺失的毒株能誘導(dǎo)SG的形成，說(shuō)明C蛋白在抑制SG形成的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，但機(jī)制尚不明確[5]。少部分報(bào)道顯示，病毒利用SG來(lái)幫助自身的復(fù)制[7-9]。如西尼羅河病毒（West Nile virus,WNV）RNA 3'端莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)對(duì)SG成核蛋白TIA1的“劫持”，抑制對(duì)亞砷酸鈉應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的SGs的形成，從而促進(jìn)病毒的復(fù)制[7,10]。SG是一個(gè)動(dòng)態(tài)的RNA和蛋白聚合物結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞壓力緩解后，SG解聚，mRNA和翻譯相關(guān)因子回歸到核糖體，重啟蛋白翻譯；如果壓力持續(xù)存在，SG的mRNA進(jìn)入P小體（processing bodies），發(fā)生降解，蛋白則由自噬小體降解[11-12]。

宿主受到病毒感染時(shí)，會(huì)啟動(dòng)一系列的抗病毒反應(yīng)。在感染初期，宿主細(xì)胞主要通過(guò)天然免疫應(yīng)答抵御病毒侵染：即通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors, PRRs），識(shí)別DNA或RNA病毒的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP），激活天然免疫應(yīng)答信號(hào)通路，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素（interferon, IFN）、干擾素刺激基因（interferon stimulated gene, ISG）和炎性細(xì)胞因子，使周圍細(xì)胞處于警戒狀態(tài)，抵御病毒的進(jìn)一步感染和擴(kuò)散[13]。識(shí)別RNA病毒感染的PRRs主要包括toll樣受體（Toll-like receptors, TLRs）、RIG-I樣受體（retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors, RLRs），以及PKR（protein kinase R,PKR）[14-15]。TLR3主要位于內(nèi)體膜上，識(shí)別通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入內(nèi)含體的病毒RNA[16-17]。RIG-I和MDA5位于細(xì)胞質(zhì)，負(fù)責(zé)識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的病毒RNA[18]。PKR位于細(xì)胞質(zhì)，主要識(shí)別病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈RNA[19-20]。PRRs識(shí)別病毒核酸后，通過(guò)招募各自的適配器，將信號(hào)傳到各個(gè)激酶，最終通過(guò)磷酸化修飾激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB或IRF3/7，進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，結(jié)合細(xì)胞表面受體，激活JAK-STAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素刺激基因（IFN stimulated genes, ISGs）的表達(dá)，或激活免疫細(xì)胞，抵御病毒的感染[21-22]

仙臺(tái)病毒（Sendai virus, SeV）于20世紀(jì)50年代在日本仙臺(tái)發(fā)現(xiàn)[23]，為單鏈負(fù)鏈RNA包膜病毒，屬于副粘病毒家族，平均直徑為260 nm[24]。SeV主要感染嚙齒類動(dòng)物和豬，引起呼吸道癥狀。自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，SeV被廣泛應(yīng)用于研究：SeV對(duì)人類無(wú)致病性，對(duì)多株腫瘤細(xì)胞中具有感染性，在動(dòng)物模型中具有溶瘤作用，可開(kāi)發(fā)為溶瘤病毒[25-26]；SeV介導(dǎo)真核細(xì)胞發(fā)生膜融合，可應(yīng)用于制備單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞[27]；完整的活性SeV常作為IFN表達(dá)的誘導(dǎo)因子，用于IFN的大規(guī)模生產(chǎn)[28-29]；SeV也可作為表達(dá)載體，應(yīng)用于制備全能干細(xì)胞，或者應(yīng)用于制備疫苗[30-31]。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，不少病毒感染細(xì)胞時(shí)，天然免疫信號(hào)蛋白聚集到SG。已有的研究報(bào)道表明，SeV通過(guò)C蛋白限制雙鏈RNA的形成，避免激活PKR-eIF2α-SG通路[32]；C蛋白缺陷型SeV能誘導(dǎo)類似于SG的顆粒聚集[33]；沒(méi)有進(jìn)入核衣殼的病毒RNA，被招募到了SG[33]。SeV為何通過(guò)C蛋白抑制SG的形成？病毒RNA聚集到C蛋白缺陷型SeV誘導(dǎo)的SG，發(fā)揮了什么作用？是否參與促進(jìn)IFN反應(yīng)？本研究通過(guò)檢測(cè)PRRs和天然免疫信號(hào)傳遞蛋白在SeV感染過(guò)程中的亞細(xì)胞定位，解析以上科學(xué)問(wèn)題。我們發(fā)現(xiàn)SeV感染能夠誘導(dǎo)一部分細(xì)胞形成SGs。對(duì)這部分形成SG的細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光觀察，發(fā)現(xiàn)PRRs和天然免疫信號(hào)傳遞信號(hào)蛋白聚集到SG。我們推測(cè)SeV感染細(xì)胞時(shí)，PRRs遷移到SGs，識(shí)別病毒RNA，進(jìn)一步招募天然免疫信號(hào)傳遞蛋白，最終促進(jìn)干擾素反應(yīng)。由于SG發(fā)揮了感染信號(hào)識(shí)別和信號(hào)傳遞平臺(tái)的作用，不利于病毒復(fù)制，病毒進(jìn)化出拮抗機(jī)制，通過(guò)C蛋白減少雙鏈RNA的累積，逃逸對(duì)PKR的激活和SG的形成。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鼠G3BP1單克隆抗體（mouse monoclonal anti-G3BP1, ab56574）和兔G3BP1單克隆抗體（Rabbit Anti-G3BP antibody, ab181150）購(gòu)自Abcam公司；兔MDA5單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-MDA5, 5321T）和RIG-I單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-RIG-I, 3743S）、兔TBK1單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-TBK1, 38066S）、兔IKKε單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-IKKε,9966T）、兔TAK1單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-TAK1, 5206S）、兔DDX3單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-DDX3, 8192S）、兔IKKβ單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-IKKβ, 9966T）、兔A20單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-A20, 5630S）和兔CYLD單克隆抗體（rabbit monoclonal anti-CYLD,8462S）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞與病毒HeLa細(xì)胞購(gòu)自ATCC，并由本實(shí)驗(yàn)室保存。用含10%FBS（Hyclone）和1%青霉素/鏈霉素的DMEM（Gibco），置于含5%CO2、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SeV由揚(yáng)州大學(xué)張泉饋贈(zèng)，并由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 SeV感染用鑷子取25 mm細(xì)胞飛片在酒精燈外焰滅菌，涼卻后輕輕放入6孔細(xì)胞板中。將HeLa細(xì)胞按5～6×105個(gè)鋪至細(xì)胞板中，搖晃均勻，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%，進(jìn)行接毒實(shí)驗(yàn)。取無(wú)菌15 mL離心管，用無(wú)血清的DMEM稀釋病毒，每孔細(xì)胞加入1 mL的無(wú)血清DMEM稀釋的病毒液，病毒感染量為1 MOI（multiplicity of infection）。置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h，PBS清洗3遍細(xì)胞，加入含2%FBS的DMEM，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。待感染后16 h，收取細(xì)胞樣品，進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

1.4 polyI:C轉(zhuǎn)染用鑷子取25 mm細(xì)胞飛片在酒精燈外焰滅菌，涼卻后輕輕放入6孔細(xì)胞板中。消化HeLa細(xì)胞或Vero細(xì)胞，將細(xì)胞按5～6×105個(gè)鋪至細(xì)胞板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)需要準(zhǔn)備無(wú)RNA酶EP管及槍頭，EP管中加入Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基100 μL，按照質(zhì)量體積比1∶2先加入轉(zhuǎn)染試劑Fugene，吹打混勻后靜止5 min，然后再加入2 μg polyI:C，再次輕輕吹打混勻后室溫靜置15 min，最后將其滴加在事先鋪滿Opti-MEM?的細(xì)胞孔內(nèi)。

1.5 間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay, IFA）病毒感染后的16 h，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含4%多聚甲醛的PBS固定液，室溫固定10 min。吸去多聚甲醛固定液，PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含0.5%Triton X-100的PBS透化液，室溫透化10 min。吸去透化液，用PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含3%BSA的PBS封閉液，放入37℃恒溫箱中封閉30 min。吸去封閉液，用PBS清洗3遍，跟G3BP1抗體稀釋液37℃共孵育1 h；TBST清洗3遍，加入熒光二抗稀釋液37℃共孵育30 min。TBST清洗3遍，依次孵育第二組一抗和熒光二抗。全部抗體孵育完畢后，TBST清洗3次，跟DAPI稀釋液37℃共孵育15 min。棄去DAPI稀釋液，TBST清洗3次，加抗熒光淬滅封片劑，將細(xì)胞飛片取出，吸干多余水分放到載玻片上，置于黑暗處過(guò)夜晾干。通過(guò)ZEISS激光共聚焦顯微鏡觀察SG的形成和相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果

2.1 MDA5和RIG-I在SeV的感染過(guò)程中聚集于SGs在病毒的感染過(guò)程中，PRRs識(shí)別病毒感染產(chǎn)生的PAMP，發(fā)生信號(hào)傳遞，最終發(fā)生抗病毒反應(yīng)。我們推測(cè)參與識(shí)別病毒感染的PRRs，在病毒感染過(guò)程中會(huì)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)遷移，在空間上接近PAMP。RIG-I和MDA5主要識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的病毒雙鏈RNA，激活位于線粒體的MAVS，傳遞信號(hào)到TBK1和IKKε，最終激活I(lǐng)RF3，誘導(dǎo)IFN的表達(dá)[17]。在本研究中，我們首先檢測(cè)SeV感染是否誘導(dǎo)細(xì)胞形成SG；同時(shí)檢測(cè)在SeV感染過(guò)程中，RIG-I和MDA5 的亞細(xì)胞定位是否發(fā)生變化。以1 MOI SeV感染宮頸癌細(xì)胞HeLa，設(shè)置模擬感染（mock infection）為對(duì)照組。感染后16 h，利用G3BP1鼠抗和MDA5兔抗，或G3BP1鼠抗和RIG-I兔抗，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)SG核心蛋白G3BP1和MDA5或RIG-I的亞細(xì)胞定位。G3BP1的聚集，是SG形成的標(biāo)志。如圖1所示，在模擬感染的對(duì)照組，G3BP1均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，沒(méi)有觀察到G3BP1聚集顆粒的形成；MDA5和RIG-I均勻分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；在SeV感染的實(shí)驗(yàn)組，大部分感染細(xì)胞中的G3BP1均勻分布在細(xì)胞質(zhì)，MDA5和RIG-I也均勻分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；只有少部分感染細(xì)胞的G3BP1發(fā)生點(diǎn)狀聚集，形成SG；同時(shí)，MDA5和RIG-I也發(fā)生點(diǎn)狀聚集，跟G3BP1顆粒共定位。以上結(jié)果說(shuō)明SeV感染在大部分細(xì)胞不誘導(dǎo)形成SGs，僅誘導(dǎo)一小部分細(xì)胞形成SG； MDA5和RIG-I遷移到SGs。

圖1 RIG-I和MDA5的免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)Fig.1 Confocal immunofluorescence assay of RIG-I and MDA5

2.2 IRF3信號(hào)通路蛋白激酶TBK1和IKKε在SeV的感染過(guò)程中聚集于SG已有報(bào)道顯示C蛋白缺陷型SeV感染后，誘導(dǎo)大量SG形成，沒(méi)有核衣殼蛋白包裹的病毒RNA進(jìn)入SG[33]。本研究發(fā)現(xiàn)RIG-I和MDA5遷移到SG，說(shuō)明這兩個(gè)PRRs很有可能在SG對(duì)病毒RNA進(jìn)行識(shí)別，并進(jìn)一步激活MAVS，在線粒體膜上發(fā)生聚集，招募并激活下游信號(hào)蛋白TRAF3，形成IKKε/TBK1復(fù)合體，磷酸化激活I(lǐng)RF3進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)IFN的表達(dá)和分泌[17]。RIG-I和MDA5對(duì)MAVSIKKε/TBK1的激活，需要有空間上的接觸。我們接下來(lái)檢測(cè)IKKε和TBK1在SeV感染過(guò)程中的亞細(xì)胞定位。以1 MOI SeV感染HeLa細(xì)胞，設(shè)置模擬感染為對(duì)照組。感染后16 h，利用G3BP1鼠抗和TBK1兔抗，或G3BP1鼠抗和IKKε兔抗進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)SG核心蛋白G3BP1和IRF3信號(hào)通路的激酶TBK1或IKKε的亞細(xì)胞定位。如圖2所示，在模擬感染的細(xì)胞中，G3BP1均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，沒(méi)有觀察到SG的形成；TBK1或IKKε也均勻分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；在SeV感染的細(xì)胞中，一部分細(xì)胞的G3BP1發(fā)生點(diǎn)狀聚集，形成SG；TBK1和IKKε發(fā)生點(diǎn)狀聚集，跟G3BP1顆粒共定位。以上結(jié)果說(shuō)明TBK1和IKKε聚集于SeV誘導(dǎo)的SG，參與信號(hào)傳遞。

圖2 TBK1和IKKε的免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)Fig.2 Confocal immunofluorescence assay of TBK1和IKKε

2.3 NF-κB信號(hào)通路蛋白激酶TAK1，IKKβ和RNA解旋酶DDX3在SeV的感染過(guò)程中聚集于SG作為TLRs模式識(shí)別受體的信號(hào)蛋白，TLR3主要識(shí)別RNA病毒，招募信號(hào)蛋白MyD88，激活TRAF6；TRAF6經(jīng)過(guò)k63連接的聚泛素化，作為一個(gè)支架蛋白招募TAK1；磷酸化的TAK1隨后磷酸化激活I(lǐng)KKα/β/γ復(fù)合物[16]；IKKβ進(jìn)一步對(duì)IκB進(jìn)行磷酸化；IκB隨后發(fā)生泛素化降解，釋放轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)IFNβ、TNFα和IL6等細(xì)胞因子的表達(dá)[17]。DDX3（DEAD-box helicase 3）是RNA解旋酶，參與天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，常常被病毒劫持以促進(jìn)復(fù)制[34-35]。已有的研究表明，過(guò)表達(dá)DDX3促進(jìn)SG組裝，而敲減DDX3的表達(dá)則抑制SG組裝；同時(shí)DDX3的解旋酶活性對(duì)SG組裝必不可少，且DDX3與eIF4E結(jié)合是SG組裝所必需的[36]。DDX3的RNA解旋酶活性使mRNA從RNA顆粒中逃逸并在多聚體處恢復(fù)翻譯[37]。TAK1和IKKβ參與信號(hào)傳遞，DDX3不但參與信號(hào)傳遞，還是SGs組裝過(guò)程中必不可少的蛋白。本研究進(jìn)一步對(duì)在SeV感染過(guò)程中，這些信號(hào)蛋白是否遷移到SG進(jìn)行檢測(cè)。以1 MOI SeV感染HeLa細(xì)胞，設(shè)置模擬感染為對(duì)照組。感染后16 h，利用G3BP1鼠抗和TAK1兔抗、G3BP1鼠抗和IKKβ兔抗，或G3BP1鼠抗和DDX3兔抗進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)G3BP1和NF-κB信號(hào)通路的蛋白激酶TAK1、IKKβ、或RNA解旋酶DDX3的亞細(xì)胞定位。如圖3所示，在模擬感染的細(xì)胞中，G3BP1均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，沒(méi)有觀察到SG的形成；蛋白激酶TAK1、IKKβ，或RNA解旋酶DDX3也均勻分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；在SeV感染的一部分細(xì)胞中，G3BP1形成點(diǎn)狀聚集，形成SGs；TAK1、IKKβ或DDX3也形成點(diǎn)狀聚集，跟G3BP1共定位。以上結(jié)果說(shuō)明SeV感染誘導(dǎo)TAK1、IKKβ和DDX3聚集于SGs。

圖3 TAK1、DDX3和IKKβ的免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)Fig.3 Confocal immunofluorescence assay of TAK1、DDX3和IKKβ

2.4 泛素化酶和去泛素化酶A20以及去泛素化酶CYLD在SeV的感染過(guò)程中聚集于SGA20，也被稱為腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3（tumor necrosis factor induced protein 3, TNFIP3），具有泛素連接酶和去泛素化酶的功能，由NF-κB誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)RIP1和其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)行泛素化或去泛素化，負(fù)向調(diào)控NF-κB信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，形成負(fù)反饋回路[38-39]。A20阻止了IFN和細(xì)胞因子的大量表達(dá)，對(duì)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。CYLD（cylindromatosis）是一種去泛素化酶，屬于去泛素化酶USP家族（ubiquitinspecific proteases），通過(guò)其C末端的泛素水解結(jié)構(gòu)域，可以特異性的從蛋白底物上除去K63連接的泛素鏈，從而改變靶蛋白的功能[40-42]。同時(shí)，CYLD還具有一個(gè)特異性位點(diǎn)，可以與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（tumor receptor-associated factor 2, TRAF2）和NF-κB信號(hào)通路激酶（(NF)-kappaB essential modulator, NEMO）結(jié)合[43]。因此，A20和CYLD在NF-κB號(hào)通路的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[44]。我們接下來(lái)對(duì)A20和CYLD進(jìn)行檢測(cè)，觀察其在SeV感染過(guò)程中亞細(xì)胞定位的變化。以1 MOI SeV感染HeLa細(xì)胞，設(shè)置模擬感染為對(duì)照組。感染后16 h，利用G3BP1鼠抗和A20兔抗，或用G3BP1鼠抗CYLD兔抗進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)G3BP1和泛素化相關(guān)酶A20或CYLD的亞細(xì)胞定位。如圖4所示，在模擬感染的細(xì)胞中，G3BP1均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，沒(méi)有觀察到SG的形成；A20和CYLD也均勻分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；在SeV感染組，一部分細(xì)胞中的G3BP1形成點(diǎn)狀聚集，形成SGs；A20和CYLD形成點(diǎn)狀聚集，跟G3BP1共定位。以上結(jié)果說(shuō)明SeV感染誘導(dǎo)SGs的形成，參與信號(hào)傳導(dǎo)的A20和CYLD聚集于SGs。

圖4 A20和CYLD的免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)Fig.4 Confocal immunofluorescence assay of A20和CYLD

2.5 A20及其磷酸化形式p-A20在poly I:C刺激下聚集于SG如前所述，在SeV感染Hela細(xì)胞的過(guò)程中，很多與天然免疫相關(guān)的信號(hào)蛋白會(huì)聚集到SG。然而，信號(hào)蛋白聚集到SG是否為SEV感染細(xì)胞特有的現(xiàn)象，尚不清楚。poly I:C是病毒雙鏈RNA模擬物，能夠通過(guò)激活PKR，刺激SG的形成，并激活干擾素信號(hào)通路。因此，poly I:C刺激能夠模擬RNA病毒感染。我們將探討在poly I:C刺激細(xì)胞后，天然免疫信號(hào)蛋白是否聚集于SG。我們接下來(lái)以A20及磷酸化活化的A20（p-A20）為代表性蛋白進(jìn)行檢測(cè)和分析。在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染poly I:C，設(shè)置PBS轉(zhuǎn)染為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后16 h，利用G3BP1鼠抗和A20兔抗或p-A20兔抗進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)G3BP1和A20及p-A20的亞細(xì)胞定位。如圖5所示，在PBS刺激的細(xì)胞中，G3BP1均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，沒(méi)有觀察到SG的形成；A20均勻分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；在poly I:C刺激的細(xì)胞中，G3BP1形成點(diǎn)狀聚集，形成SG；一定比例的A20和p-A20形成點(diǎn)狀聚集，跟G3BP1共定位。以上結(jié)果說(shuō)明poly I:C刺激能誘導(dǎo)SG的形成，參與信號(hào)傳導(dǎo)的A20及其活性形式p-A20聚集于SG。以上結(jié)果揭示，信號(hào)蛋白聚集到SG并不是SEV感染特有的現(xiàn)象。

圖5 A20和p-A20的免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)Fig.5 Confocal immunofluorescence assay of A20和p-A20

3 討論

在病毒感染細(xì)胞時(shí)，天然免疫應(yīng)答是宿主的第一道抵御防線。干擾素是天然免疫應(yīng)答的關(guān)鍵抗病毒蛋白，由PRRs識(shí)別病毒感染后，激活I(lǐng)RF3/IRF7或NF-κB誘導(dǎo)表達(dá)。病毒感染產(chǎn)生的雙鏈RNA，結(jié)合并激活PKR，PKR進(jìn)一步磷酸化eIF2α，使蛋白翻譯所需的三元復(fù)合物eIF2-GTP-Met-tRNAMet不能循環(huán)利用，細(xì)胞迅速終止蛋白翻譯，在細(xì)胞質(zhì)中形成的致密顆粒狀聚合體SG，臨時(shí)儲(chǔ)存mRNA和翻譯元件。已有的研究顯示，RIG-I和PKR在NS1缺失的禽流感A型病毒（Influenza A virus, IAV）的感染過(guò)程中，遷移到SG，SG發(fā)揮促進(jìn)干擾素反應(yīng)的作用[45]，因此，SG在IAV的感染中，具有抗病毒作用。IAV進(jìn)化出干擾SG形成的機(jī)制：非結(jié)構(gòu)蛋1（NS1）通過(guò)抑制PKR的激活，避免磷酸化eIF2α，從而不誘導(dǎo)SG的形成；而NS1缺失型IAV（IAV-NS1），則顯著地誘導(dǎo)依賴于PKR-eIF2α途徑的SG形成[3,45]。有報(bào)道顯示：脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus, PV）和腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus, EMCV)，這兩種病毒能暫時(shí)誘導(dǎo)SG形成，但是病毒3C蛋白具有切割SG核心蛋白G3BP1的功能，從而抑制SG形成[19,46]。有研究表明，SeV通過(guò)C蛋白減少雙鏈RNA的累積，逃逸對(duì)PKR的激活和對(duì)SG的誘導(dǎo)。C蛋白缺陷型SeV有效刺激SG的形成，沒(méi)有核衣殼的病毒RNA遷移到SG。SeV具有拮抗SG的機(jī)制，那么，SG在SeV感染過(guò)程中，是否發(fā)揮抗病毒作用呢？

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SeV感染HeLa細(xì)胞的過(guò)程中，大部分感染的細(xì)胞不形成SG，一小部分細(xì)胞形成SGs。RNA感受器MDA5和RIG-I，下游的蛋白激酶如TBK1、IKKε、TAK1，IKKβ、RNA解旋酶DDX3、泛素化酶和去泛素化酶A20以及去泛素化酶CYLD均聚集到SG。結(jié)合前人的研究，我們推測(cè)在SeV感染細(xì)胞的過(guò)程中，病毒RNA被招募到SGs，PRRs遷移到SGs，識(shí)別病毒RNA，把信號(hào)傳遞給下游的激酶，最終激活I(lǐng)RF3/7和NF-κB，誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)。因此，我們預(yù)測(cè)在SeV感染過(guò)程中，SG是宿主識(shí)別病毒感染并發(fā)生信號(hào)傳遞的一個(gè)平臺(tái)，SeV通過(guò)C蛋白拮抗SG的形成，減少宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。

天然免疫相關(guān)的信號(hào)蛋白聚集到SG，并不是SeV感染特有的現(xiàn)象。在我們的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)poly I:C刺激誘導(dǎo)的SG，也具有PRRs和A20等天然免疫相關(guān)蛋白。并且，G3BP1/2缺失的細(xì)胞系，在poly I:C刺激下，不能形成SG，干擾素反應(yīng)明顯下降。因此，SG在病毒感染過(guò)程中作為一個(gè)啟動(dòng)或增強(qiáng)天然免疫應(yīng)答的信號(hào)平臺(tái)，發(fā)揮抗病毒作用[47]。本研究證實(shí)了在病毒感染細(xì)胞的過(guò)程中，信號(hào)蛋白聚集到SG是一種普遍現(xiàn)象，為進(jìn)一步明確SG在抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮的作用提供參考，同時(shí)揭示細(xì)胞壓力應(yīng)激與干擾素反應(yīng)存在交叉聯(lián)系。