姚 云，張毅峰，王帥勇，虞凌雪，朱世強，王 娟，單同領(lǐng)，周艷君，童 武，鄭 浩，李國新，童光志，于 海,2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

猴子流感病毒對人類和動物健康構(gòu)成了潛在威脅。流感病毒分為甲型、乙型和丙型[1]，基于遺傳和抗原差異，可感染哺乳動物和鳥，在三種類型流感病毒中，甲型流感病毒被視為是最重要的病原體，臨床上會導(dǎo)致人類和家畜的嚴重流行病。通過氣溶膠飛沫傳播的病毒會導(dǎo)致人類呼吸系統(tǒng)疾病，引起嚴重的肺炎甚至引發(fā)死亡。

豬流感病毒（Swine influenza virus, SIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，其為單股、負鏈RNA病毒，基因組分節(jié)段，含有8個基因，可編碼多種蛋白質(zhì)。豬群感染豬流感之后臨床癥狀主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、精神沉郁、打噴嚏、高燒、嗜睡、呼吸困難和食欲下降等。不同于大多數(shù)負義RNA病毒，流感病毒基因組是在感染細胞的核內(nèi)進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的。在基因組RNA和病毒蛋白合成以后，核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein, RNP）在細胞核中合成，由病毒蛋白M1和核輸出蛋白（NEP/NS2）介導(dǎo)輸出到細胞質(zhì)中。RNPs在細胞內(nèi)被運送到出芽部位，即極化細胞頂端質(zhì)膜上的脂質(zhì)筏。而跨膜蛋白HA、NA、M2則是由通過標準的胞外途徑被轉(zhuǎn)運至細胞表面[2-3]。RNPs被推測為與質(zhì)膜上的M1蛋白或者質(zhì)膜上HA、NA和M2蛋白的胞質(zhì)尾端相互作用，而后被包裝成病毒顆粒[4-5]。最后，所有的病毒成分完成組裝，形成子代病毒粒子，通過膜分裂的方式從頂端的質(zhì)膜出芽。

因豬的呼吸道上皮細胞同時擁有人類流感和禽流感病毒的受體，所以豬群對于人類流感和禽流感也易感，常常扮演著“基因混合器”的角色，在豬體內(nèi)形成更多的重組病毒，因此可能導(dǎo)致新的大流行毒株。此外，與其他RNA病毒一樣，流感病毒依賴RNA的RNA聚合酶也很容易出錯，因此突變頻繁發(fā)生，并且沒有能夠消除這種情況的校對框架，導(dǎo)致無法控制合理變異病毒的進化。因而由于流感病毒的高突變率與高復(fù)制率，使得病毒能夠迅速適應(yīng)環(huán)境變化，從而逃脫宿主現(xiàn)有的免疫力，一定程度上為流感大流行奠定了基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建了H3N2亞型SIV的反向遺傳操作系統(tǒng)，通過序列測定、細胞病變等證明拯救出的病毒與野生毒株的生物學(xué)特性一致。本研究中H3N2亞型SIV的成功拯救為豬流感病毒的分子致病機制研究以及疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞豬流感病毒A/Swine/Guangdong/164/2006（H3N2）、細胞293T、MDCK均由本實驗室保存。

1.2 實驗試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒（RNeasy Mini Kit）、質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；磷酸緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、胰酶、DMEM均購自Gibco公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.3 引物設(shè)計參照參考文獻[6]中的方法，利用引物設(shè)計軟件，設(shè)計合成出流感病毒8個基因片段的通用引物以及反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12（表1）。

1.4 病毒RNA的提取及目的片段的擴增將病毒進行擴增，收取病毒液，按照相關(guān)說明書提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模版，根據(jù)通用引物擴增H3N2亞型毒株的所有基因片段。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及純化根據(jù)設(shè)計的引物進行目的基因的擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗來鑒定擴增條帶大小。膠回收目的條帶，將其和PBD載體用BspQⅠ進行酶切處理，膠回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶置于16℃條件下連接過夜，繼而將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，密切觀察平板上的菌落生長狀況，待其大小適宜時，挑取單個菌落放入LB培養(yǎng)基（氨芐抗性）中培養(yǎng)，取適量菌液進行鑒定，挑選陽性克隆送至生物公司進行序列測定。序列比對無誤后，用甘油保存菌液，同時吸取適量菌液進行大量擴增，提取質(zhì)粒，測完濃度標記好保存于-20℃冰箱。

1.6 病毒的拯救將8個質(zhì)?；旌霞尤胪粋€EP管中，每個質(zhì)粒的量為1 μg，加入150 μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，吹打混勻；準備另一干凈的EP管，吸取20 μL轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和150 μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基加入其中，吹打混勻后作用5 min，而后將其加入到含有質(zhì)粒的EP管中，充分混勻，室溫作用20 min；期間用提前預(yù)熱好無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基將293T細胞清洗兩遍，將作用好的混合物加入其中，輕輕混勻。24 h后，每孔加入1 mL的無血清Opti-MEM（內(nèi)含8%BSA），于54 h后在鏡下觀察細胞狀態(tài)而后收取上清液。取適量上清液接種到MDCK細胞中，待細胞在鏡下出現(xiàn)明顯病變時，收集病毒上清液保存于-20℃冰箱。

表1 病毒全基因組通用引物Table 1 Primers for amplifying the full-length fragments of the virus

1.7 拯救病毒的鑒定取出病毒液，選用雞的紅細胞檢測血凝效價，再提取拯救病毒的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)合成的通用引物擴增病毒的8個基因片段，純化后送至生物公司進行序列測定，驗證相關(guān)基因片段是否正確。

2 結(jié)果

2.1 H3N2亞型SIV 8個基因片段的RT-PCR擴增提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)流感病毒的引物，擴增病毒的8個基因片段，轉(zhuǎn)染至293T細胞，成功拯救病毒（圖1）。

圖1 8個基因片段的擴增結(jié)果Fig.1 PCR products of 8 genes of wild strain

2.2 重組PBD陽性質(zhì)粒的鑒定H3N2亞型SIV基因片段的膠回收產(chǎn)物和PBD載體用BspQⅠ進行酶切處理，膠回收目的片段，用T4 DNA連接酶于16℃條件下連接過夜，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，挑取單克隆菌落放入LB培養(yǎng)基（氨芐抗性）中培養(yǎng)，取適量菌液進行鑒定，挑選陽性克隆送至生物公司進行序列測定，結(jié)果表明，測序結(jié)果與野生株序列一致（圖2）。

圖2 8個重組質(zhì)粒的菌液鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of 8 recombinant PBD plasmids

2.3 拯救病毒過程中的細胞病變轉(zhuǎn)染54 h后，收集病毒液上清液，取適量接種至生長狀態(tài)良好的MDCK細胞，密切觀察細胞病變情況。與正常細胞（圖3A）相比，接種病毒液48 h后的細胞（圖3B）于顯微鏡下出現(xiàn)明顯病變。

圖3 接種拯救病毒后細胞出現(xiàn)的病變Fig.3 Cytopathic effects of cells after infection of rH3N2 virus

2.4 拯救病毒的血凝效價待MDCK細胞脫落80%-90%時，收取病毒上清液，使用新鮮的1%雞紅細胞做血凝實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拯救毒株與野生毒株血凝效價一致，均為23。

2.5 拯救病毒的RT-PCR鑒定將拯救的病毒提取RNA再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模版，根據(jù)通用引物擴增出8個基因片段，將其純化后送至生物公司測序，經(jīng)比對，測序結(jié)果與野生株序列一致，代表此病毒拯救成功（圖4）。

圖4 拯救病毒8個基因片段的擴增結(jié)果Fig.4 PCR products of 8 genes of rescued virus

3 討論

反向遺傳學(xué)技術(shù)以質(zhì)粒為基礎(chǔ)，將病毒基因組的全長互補DNA拷貝轉(zhuǎn)染至易感細胞來制造重組的豬流感病毒。對于回答有關(guān)豬流感病毒生物學(xué)的重要問題，反向遺傳學(xué)系統(tǒng)為其提供了強有力的技術(shù)支持，其中包括研究病毒蛋白的功能、病毒的毒力及致病性、病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的機制、病毒與宿主細胞因子之間的相互作用，以及解析流感病毒的傳播及其發(fā)病機制。基于反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救的重組豬流感病毒，也為開發(fā)滅活和減毒流感疫苗提供了強有力的支撐，奠定了良好的基礎(chǔ)。

運用遺傳學(xué)技術(shù)產(chǎn)生重組病毒最初是針對DNA病毒而開發(fā)的，其基礎(chǔ)是用編碼病毒基因組的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，或者用攜帶病毒序列的質(zhì)粒與病毒基因組以及輔助病毒進行異源重組[7]。而在掌握了DNA病毒的初始遺傳學(xué)方法之后，便開始了針對正義RNA病毒基因組的操作[8-9]。然而，與DNA抑或正義RNA病毒相比，對于負義RNA病毒的基因組（包括流感），其實是不太適合進行分子生物學(xué)操作，因為它們的基因組在方向上與mRNA互補，因此其本身不具有感染性[10]。它們需要依賴vRNA（s）和病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）來啟動病毒的復(fù)制周期[11-12]。作為以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的流感病毒反向遺傳學(xué)，其需要參與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的病毒組分RNP（PB2、PB1、PA和NP）和8個負鏈病毒RNA在轉(zhuǎn)染至易感細胞時瞬時表達，共同產(chǎn)生新的重組IAV。反向遺傳學(xué)和分子工程的出現(xiàn)改變了流感領(lǐng)域的發(fā)展，科研人員便可以利用基因工程拯救的重組流感病毒解決多個存疑問題。

目前，國內(nèi)SIV主要流行亞型為H1N1、H1N2和H3N2亞型[13]。現(xiàn)如今豬流感已經(jīng)成為養(yǎng)豬業(yè)防控的重要病原體，其對公共衛(wèi)生和人類流感的控制也構(gòu)成了威脅[14]。豬對于禽流感和人流感病毒頗為敏感，因其呼吸道上皮細胞存在這兩種病毒的受體，所以在豬體內(nèi)，豬流感病毒和其他兩種病毒之間可能會發(fā)生基因重組，形成更多的重組病毒[15]。A型流感病毒的抗原和遺傳進化常常伴隨著種間傳播，而新宿主的進化變化則是由突變、重組等一系列過程引起的，這對于人類健康構(gòu)成潛在的威脅，促使相關(guān)部門進一步實施更有系統(tǒng)的監(jiān)測，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[16]。感染SIV后豬群的免疫力會降低，這便很容易造成SIV和其他病毒或細菌的二次以及混合感染，例如豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒以及其他致病菌，這在很大程度上影響了畜牧業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展。H3N2亞型SIV反向遺傳操作技術(shù)平臺的建立將為流感病毒的分子致病機制的研究提供強有力的支撐，同時也為開發(fā)滅活和減毒流感疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)[17]。