劉待見(jiàn)，劉劍波

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科 鄭州 450014

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)病，可以引起肺部嚴(yán)重病變，同時(shí)具有顯著的肺外(全身)影響[1]，其中骨骼肌萎縮伴功能障礙是重要表現(xiàn)之一。在COPD病程中，骨骼肌萎縮出現(xiàn)早，發(fā)生率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后，但目前COPD患者骨骼肌萎縮發(fā)生機(jī)制不明確，治療措施有限。研究[2-4]表明骨骼肌萎縮發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)多種代謝途徑參與，其中鈣蛋白酶(Calpain)途徑和泛素-蛋白酶途徑是研究較為廣泛的途徑。Calpain途徑可拆卸肌原纖維成為肌絲片段，從而啟動(dòng)肌纖維蛋白降解；泛素-蛋白酶體途徑可將較大的蛋白質(zhì)肽鏈徹底水解為小的肽段或者游離氨基酸。兩個(gè)途徑均屬于蛋白降解系統(tǒng)，通過(guò)降解蛋白，有序參與肌纖維蛋白降解，是參與骨骼肌萎縮的重要途經(jīng)。本課題組前期研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，Calpain及其內(nèi)源性抑制劑Calpastatin在COPD大鼠骨骼肌中表達(dá)增強(qiáng)，可能參與骨骼肌萎縮。本研究通過(guò)外源性Caplain抑制劑干預(yù)，進(jìn)一步研究Calpain途徑在COPD大鼠骨骼肌萎縮中的作用以及對(duì)泛素-蛋白酶體途徑的影響，為防治COPD骨骼肌萎縮提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料48只10周齡SPF級(jí)大鼠，體重(218.5±16.9) g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；紅旗渠牌香煙(河南中煙工業(yè)公司安陽(yáng)卷煙廠，烤煙型，焦油量13 mg，CO量13 mg，煙氣煙堿量1.1 mg )，豬胰彈性蛋白酶、DMSO、26S蛋白酶體抑制劑(MG-132)及底物(美國(guó)Sigma公司)，Calpeptin(德國(guó)Merck Millipore公司)，Bradford蛋白定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(鄭州邁思生物科技有限公司)，Calpain活性熒光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Biovision公司)。

1.2 模型制備及動(dòng)物分組適應(yīng)環(huán)境1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠分為模型組(30只)、健康對(duì)照組(18只)。造模第1～29天、第31～60天，將模型組大鼠置于煙霧染毒箱(80 cm×60 cm×58 cm)內(nèi)行香煙煙霧刺激(分2次點(diǎn)燃香煙，10支/次，30 min/次)，2次/d；健康對(duì)照組不做任何干預(yù)。第30天，將豬胰彈性蛋白酶200 U/kg注入模型組大鼠氣管內(nèi)；將等量生理鹽水注入健康對(duì)照組氣管內(nèi)。造模結(jié)束后，分別在模型組和健康對(duì)照組隨機(jī)選取6只大鼠行肺通氣功能測(cè)定，處死并留取大鼠肺、趾長(zhǎng)伸肌(extensor digitorum longus，EDL)標(biāo)本行病理檢查。模型組剩余大鼠再按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Calpeptin干預(yù)組和陰性對(duì)照組，各12只。Calpeptin干預(yù)組小鼠肌內(nèi)注射0.2 mL Calpeptin，劑量2 mg/(kg·d)，連續(xù)4周；同時(shí)，陰性對(duì)照組給予DMSO 0.2 mL。干預(yù)后1周、4周分別處死6只大鼠。具體分組見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

1.3 肺通氣功能測(cè)定大鼠麻醉后備皮，分離氣管，水平剪開(kāi)氣管，置入Y型管，接呼吸換能器，測(cè)量最大呼氣流速(PEF)、用力呼氣容積(FVC)、第0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)，計(jì)算FEV0.3/FVC。

1.4 標(biāo)本收集急性失血法處死大鼠，完整分離大鼠左右兩側(cè)EDL，稱重并記錄，左側(cè)EDL分成兩部分，一部分置于40 g/L多聚甲醛中固定，待病理學(xué)檢測(cè)，另一部分投入液氮罐中凍存以備RT-PCR、蛋白酶活性檢測(cè)。40 g/L多聚甲醛液經(jīng)右心室沖洗雙肺至表面顏色變白，分離右肺，在與支氣管垂直的截面最大周徑處留取肺組織標(biāo)本，放入40 g/L多聚甲醛中固定。

1.5 組織病理學(xué)檢測(cè)肺組織和EDL組織固定24 h以上，石蠟包埋，切片，HE染色，閱片，留圖。

1.6 大鼠EDL中Calpains、肌肉萎縮盒F蛋白(Atrogin-1)、肌肉環(huán)狀指蛋白1(MuRF-1) mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)取EDL約50 mg至研缽內(nèi)，加液氮研磨，加入1 mL Trizol提取總RNA，進(jìn)行RNA 含量檢測(cè)。嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR操作。m-Calpain上游引物5’-CATTTGACTGAC CAACTGAGCC-3’，下游引物5’-ACGTTTGGAAGT GGATAAGGCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小188 bp。μ-Calpain上游引物5’-TCCCTCTGCAAACCAAAGTACA-3’，下游引物5’-ACTGCACTGAAACATGGGACCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小207 bp。Atrogin-1上游引物5’-AGTGAAGACCGGCTACTGTGGAA-3’，下游引物5’-TTGCAAAGCTGCAGGGTGAC-3’ ，擴(kuò)增產(chǎn)物大小176 bp。MuRF-1上游引物5’-GGGAACGAC CGAGTTCAGACTATC-3’，下游引物5’-GGCGT CAAACTTGTGGCTCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小108 bp。GAPDH上游引物5’-CACGGCAAGTTCAACGGCA CA-3’，下游引物序列5’-GCGGCATGTCAGATCCA CAACG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小588 bp。產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外透射儀(暗箱式)中成像，BandScan凝膠電泳圖像分析軟件處理數(shù)據(jù)，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參灰度值比值。

1.7 EDL中Calpain活性的測(cè)定將約50 mg EDL剪碎，置入1.5 mL EP管中，加入預(yù)冷的裂解液，高速勻漿，0 ℃靜置15 min。4 ℃，12 000 r/min離心30 min，收集上清液，嚴(yán)格按照Calpain活性熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.8 EDL中26S蛋白酶體活性測(cè)定取50 mg EDL組織，按照操作規(guī)范進(jìn)行蛋白提取，并采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，在黑色熒光檢測(cè)專用96孔板中進(jìn)行，先后加入分析緩沖劑、樣品、抑制劑、底物后，進(jìn)行熒光檢測(cè)。實(shí)際讀數(shù)=(樣品讀數(shù)-背景對(duì)照讀數(shù))÷蛋白含量÷檢測(cè)時(shí)間。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較健康對(duì)照組、Calpeptin干預(yù)組和陰性對(duì)照組(3組)大鼠EDL質(zhì)量和EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA的表達(dá)以及Calpain、26S蛋白酶體活性的差異，Pearson直線相關(guān)分析陰性對(duì)照組和Calpeptin干預(yù)組大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性以及Calpain活性與26S蛋白酶體活性的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺通氣功能比較見(jiàn)表1。與健康對(duì)照組比較，模型組大鼠PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC值均下降，提示COPD模型構(gòu)建成功。

表1 大鼠肺通氣功能比較

2.2 3組大鼠EDL質(zhì)量比較見(jiàn)表2。Calpeptin干預(yù)組和陰性對(duì)照組EDL質(zhì)量較健康對(duì)照組減輕，Calpeptin干預(yù)組EDL質(zhì)量較陰性對(duì)照組稍增加。

表2 3組大鼠EDL質(zhì)量比較 mg

2.3 3組大鼠肺組織及EDL組織病理學(xué)比較見(jiàn)圖2。陰性對(duì)照組大鼠肺組織可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜柱狀上皮細(xì)胞部分缺損、纖毛減少，腺體增生，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分形成大皰；EDL結(jié)構(gòu)松弛，肌纖維萎縮，并見(jiàn)細(xì)胞變性壞死。健康對(duì)照組大鼠肺組織及EDL組織形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整。Calpeptin干預(yù)組大鼠肺組織及EDL組織病理?yè)p傷較陰性對(duì)照組減輕；4周和1周比較，Calpeptin干預(yù)組大鼠肺組織及EDL組織病理?yè)p傷均減輕。

A：健康對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：Calpeptin干預(yù)組1周；D：Calpeptin干預(yù)組4周；1：肺組織；2：EDL組織

2.4 3組大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA的表達(dá)見(jiàn)圖3、表3。與健康對(duì)照組比較，Calpeptin干預(yù)組和陰性對(duì)照組大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA的表達(dá)均增強(qiáng)；Calpeptin干預(yù)組大鼠上述mRNA的表達(dá)均低于陰性對(duì)照組。

表3 3組大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1、MuRF-1 mRNA的表達(dá)

2.5 3組大鼠EDL中Calpain、26S蛋白酶體活性的比較見(jiàn)表4。與健康對(duì)照組比較，陰性對(duì)照組和Calpeptin干預(yù)組大鼠EDL中Calpain、26S蛋白酶體活性增強(qiáng)；與陰性對(duì)照組比較，Calpeptin干預(yù)組大鼠EDL中Calpain、26S蛋白酶體活性減弱。

A：健康對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：Calpeptin干預(yù)組；1：1周；2：4周

表4 3組大鼠EDL中Calpain、26S蛋白酶體活性

2.6 相關(guān)性分析見(jiàn)表5、6。陰性對(duì)照組和Calpeptin干預(yù)組大鼠EDL中Calpain mRNA與Atrogin-1 mRNA、MuRF-1 mRNA的表達(dá)及26S蛋白酶體活性均呈正相關(guān)。

表6 Calpain活性與26S蛋白酶體活性的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

COPD是臨床常見(jiàn)病。骨骼肌萎縮伴功能障礙是COPD常見(jiàn)不良反應(yīng)，即使輕中度COPD患者亦存在骨骼肌功能障礙，晚期COPD患者多數(shù)有嚴(yán)重骨骼肌萎縮，是COPD患者活動(dòng)能力下降和死亡的主要原因之一。骨骼肌萎縮發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，有研究[7]證實(shí)肌纖維蛋白降解加速是骨骼肌萎縮發(fā)生的重要原因；肌纖維蛋白降解由多種代謝途徑參與，其中Calpain途徑和泛素-蛋白酶體途徑是兩個(gè)重要途徑。Calpain途徑由Calpain、內(nèi)源性鈣蛋白酶抑制劑和鈣蛋白酶激活蛋白組成，Calpain是底物蛋白水解酶，內(nèi)源性鈣蛋白酶抑制劑和鈣蛋白酶激活蛋白主要對(duì)Calpain起調(diào)節(jié)作用。μ-Calpain和m-Calpain是該途徑最重要的兩種Calpain，兩者通過(guò)降解骨架蛋白和肌原纖維蛋白，拆卸肌纖維，釋放出肌絲片段[8]，最終肌絲片段被泛素-蛋白酶體等途徑水解為游離氨基酸或者肽段。泛素-蛋白酶體途徑主要包括泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)、泛素解聚酶(DUB)、26S蛋白酶體等。該途徑包括兩個(gè)步驟：泛素化和26S蛋白酶降解被泛素化的底物蛋白。Atrogin-1及MuRF1是泛素-蛋白酶體途徑中最重要的E3連接酶，在肌纖維蛋白降解中決定泛素化過(guò)程的特異性[9]；26S蛋白酶體執(zhí)行泛素-蛋白酶體途徑最后一步，將肌絲片段降解為游離氨基酸或者肽段，由此可見(jiàn)Atrogin-1、MuRF1、26S蛋白酶體均是泛素-蛋白酶體途徑中具有代表性的組分。Maltais等[10]報(bào)道，COPD患者骨骼肌中活性氧增加，引起泛素-蛋白酶體途徑激活，加速COPD肌肉蛋白降解。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，骨骼肌萎縮組的COPD患者骨骼肌中Atrogin-1與MuRF-1的表達(dá)明顯升高，提示COPD患者骨骼肌蛋白水解增加?？梢?jiàn)在COPD骨骼肌萎縮過(guò)程中，Calpain途徑和泛素-蛋白酶體途徑均起重要作用。

抽煙及蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD的主要致病原因，故本研究采用反復(fù)香煙煙霧刺激并豬胰彈性蛋白酶滴入氣道內(nèi)法制備COPD大鼠模型[12]。本研究旨在觀察Calpeptin對(duì)COPD大鼠骨骼肌中Calpain的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組大鼠EDL質(zhì)量減輕，存在EDL萎縮，Calpeptin干預(yù)組大鼠EDL質(zhì)量較陰性對(duì)照組增加，EDL組織萎縮減輕，提示Calpeptin可以減輕COPD骨骼肌萎縮。陰性對(duì)照組大鼠EDL中Calpains、Atrogin-1及MuRF-1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Calpain活性及26S蛋白酶體活性增強(qiáng)，提示COPD大鼠EDL中Calpain途徑及泛素-蛋白酶體途徑被激活，肌肉蛋白降解增加。Calpeptin干預(yù)后，Calpeptin干預(yù)組較陰性對(duì)照組大鼠EDL中Calpains mRNA表達(dá)減弱，Calpain活性減弱，提示Calpeptin可以抑制Calpains的表達(dá)及活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶體途徑中重要組分Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表達(dá)減弱及26S蛋白酶體活性減弱，且與Calpain mRNA的表達(dá)及Calpain活性相關(guān)；提示Calpeptin可以通過(guò)抑制Calpains的表達(dá)及活性，減弱泛素-蛋白酶體途徑激活，減輕COPD大鼠骨骼肌萎縮。

綜上，本研究結(jié)果顯示Calpeptin可以抑制COPD大鼠骨骼肌萎縮，為臨床治療COPD骨骼肌萎縮提供新的思路和理論依據(jù)。有研究[13]顯示，Calpain抑制劑Calpeptin可以減弱香煙煙霧誘導(dǎo)的肺部炎癥；Zhu等[14]發(fā)現(xiàn)Calpain抑制劑MDL28170可減弱COPD大鼠氣道阻力、右心室收縮壓以及支氣管和肺動(dòng)脈平滑肌增生，減輕肺氣腫，提示Calpain抑制劑不僅可以減輕骨骼肌萎縮，同時(shí)可以保護(hù)COPD肺組織，抑制氣道及肺血管重塑。鑒于Calpain抑制劑對(duì)COPD肺組織及骨骼肌的雙重保護(hù)作用，未來(lái)有待發(fā)掘可以應(yīng)用臨床的Calpain抑制劑。