王立東，陳 瑤，徐瑞華，宋 昕，趙學(xué)科，李留玉，雷玲玲，周福有，常志偉，吉佳佳，李秀敏，楊媛嘖，魏夢霞，王 苒，高社干，鮑啟德，胡景峰

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國家重點實驗室 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室 鄭州 450001 3)安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科 河南安陽 455000 4)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院新鄉(xiāng)市腫瘤分子治療重點實驗室 河南新鄉(xiāng) 453003 5)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 河南洛陽 471003 6)安陽地區(qū)醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 河南安陽 455000

隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)和后GWAS研究的深入，越來越多的疾病相關(guān)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)被發(fā)現(xiàn)。近年的研究[1-3]提示，部分疾病相關(guān)SNP可導(dǎo)致其所在基因以及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)一步影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，甚至影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸(預(yù)后)，這些發(fā)現(xiàn)極大豐富了“環(huán)境-遺傳-基因互作”模式對腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸影響的新理論；這些SNP可分為增加疾病易感性的SNP和致病性SNP兩大類。推測致病性SNP不但影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并且也可能影響驅(qū)動基因突變。

本研究團(tuán)隊利用GWAS發(fā)現(xiàn)磷脂酶Cε1(phospholipase Cε1，PLCE1)是中國人食管鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)和賁門癌的重要易感基因[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，PLCE1不僅與食管癌和賁門癌易感性有關(guān)，還與肝癌[7]、膽囊癌[8]等其他消化系腫瘤，甚至皮膚腫瘤[9]、頭頸部腫瘤[10]、膀胱腫瘤[11]、腎臟腫瘤[12]等部分消化系外腫瘤易感性有關(guān)；不僅與中國人，還與亞洲其他國家食管癌易感性有關(guān)[13-14]。PLCE1是磷脂酰肌醇信號通路中的關(guān)鍵酶，激活后可引起一系列生化反應(yīng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡，影響細(xì)胞骨架改變和細(xì)胞運動；其可與環(huán)境致癌危險因素互作，如人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16亞型感染等，促進(jìn)慢性食管炎的發(fā)生，進(jìn)一步影響食管癌的易感性[15-16]。本文就PLCE1對食管癌易感性的影響和作用機制研究現(xiàn)狀做一簡要闡述，加深對食管癌“環(huán)境-遺傳-基因互作”分子基礎(chǔ)的了解，為篩選高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)候選分子標(biāo)志物提供參考。

1 PLCE1的結(jié)構(gòu)與功能

PLCE1基因定位于常染色體10q23.32～24.1，是一個單拷貝基因，全長334.3 kb，包含34個外顯子[16]。PLCE1分子包括保守結(jié)構(gòu)域和特殊結(jié)構(gòu)域兩部分。保守結(jié)構(gòu)域為磷脂酶C家族所共有的催化結(jié)構(gòu)域，具有磷脂酶活性，包括XY結(jié)構(gòu)域、PH結(jié)構(gòu)域、EF結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域[17]。各種G蛋白介導(dǎo)的多種上游信號(激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因子等)都可匯聚于PLCE1，激活PLCE1，通過水解細(xì)胞膜上磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)，產(chǎn)生兩種重要的第二信使[三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)]，分別激活I(lǐng)P3/Ca2+和DAG/蛋白激酶C(PKC)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，從而引起Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫向細(xì)胞質(zhì)的釋放和PKC的激活[17-18]。PKC激活后可引起一系列靶蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)機體代謝。活化的PKC也可促使c-fos、c-jun等基因的反式作用因子磷酸化，加速基因表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化(圖1)[19]。PLCE1特殊結(jié)構(gòu)域包括CDC25和RA(RA1和RA2)結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域具有鳥嘌呤核苷酸交換活性(GEF)，已經(jīng)被證實為Ras家族小G蛋白(Ras、Rap1、Rap2)的效應(yīng)器[16]。CDC25能磷酸化激活Rap1A，進(jìn)一步激活下游分子引起酶促反應(yīng)，最后激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑[20]。活化的RA2與Rap2B結(jié)合后可激活PLCE1，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，最終激活H-Ras，引發(fā)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，活化的MAPK磷酸化誘導(dǎo)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖[21]。Strazza等[22]的研究顯示PLCE1介導(dǎo)了由基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α (SDF-1α)/CXC 趨化因子受體 4 (CXCR4) 誘導(dǎo)的T細(xì)胞黏附，該過程涉及 Rap1 激活，表明PLCE1在T細(xì)胞向炎癥部位募集中發(fā)揮了重要作用，推測PLCE1可能是一種具有脂肪酶和GEF雙重酶功能的蛋白質(zhì)。絕大多數(shù)的小G蛋白都是癌基因編碼產(chǎn)物，其在細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)或激活可能導(dǎo)致細(xì)胞惡變，特別是Ras基因突變可誘發(fā)腫瘤。PLCE1作為Ras基因的直接效應(yīng)因子，可能參與了腫瘤形成過程[23-24]。從上述可以看出，PLCE1作為一種多功能信號蛋白，其在上游受Ras家族GTP酶和G蛋白雙向調(diào)節(jié)，下游除引起鈣動員和PKC激活外，還可以作為Ras超家族的鳥嘌呤核苷酸交換因子，活化Ras家族小G蛋白，參與胞內(nèi)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮各種生物學(xué)功能。

圖1 磷脂酰肌醇信號通路

本研究團(tuán)隊[4]運用GWAS對2.5萬例中國漢族食管鱗癌患者和健康對照進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示PLCE1基因rs2274223位點SNP可導(dǎo)致氨基酸由組氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔险{(diào)中國漢族人群食管鱗癌患病風(fēng)險，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該SNP也可以顯著增加新疆哈薩克族和維吾爾族人群食管鱗癌及賁門腺癌的患病風(fēng)險。PLCE1基因rs2274223位點在基因座上靠近NOC3L基因，而NOC3L基因可以控制有絲分裂點并控制DNA的復(fù)制[25]，由此推測該SNP可導(dǎo)致PLCE1 DNA復(fù)制并增高其基因表達(dá)。

2 PLCE1與慢性食管炎、HPV16互作對食管癌易感性的影響

PLCE1基因rs2274223位點SNP與慢性食管炎關(guān)系密切。該SNP可導(dǎo)致從CAC(編碼組氨酸)到 CGC(編碼精氨酸)的非同義突變。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)5780G 等位基因與食管癌組織和食管癌細(xì)胞系(TE-1、TE-2、TE-7、HCE7、EC109、EC9706、SHEEC等)中PLCE1 mRNA、蛋白表達(dá)和酶活性增加有關(guān)；此外，對河南食管癌高發(fā)區(qū)10 614例無癥狀人群的觀察發(fā)現(xiàn)：5780G等位基因與中重度慢性食管炎密切相關(guān)。Guo等[27]分析了PLCE1和PKCα在人食管炎、甲基芐基亞硝胺誘發(fā)的大鼠食管癌變模型、敲除PLCE1基因的小鼠模型和人食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并結(jié)合在線腫瘤學(xué)數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)PLCE1表達(dá)變化可導(dǎo)致PKCα基因表達(dá)改變，二者可協(xié)同作用，促進(jìn)慢性食管炎的發(fā)生發(fā)展。PLCE1和PKCα的表達(dá)在Barrett食管、鱗狀上皮細(xì)胞炎性改變、食管腺癌和鱗癌及甲基芐基亞硝胺誘發(fā)的大鼠食管癌變模型中顯著升高；相反，敲除人食管上皮細(xì)胞和大鼠PLCE1基因后，上皮細(xì)胞中PKCα和一些關(guān)鍵細(xì)胞因子(如NF-κB、 IL-1β、IL-6、TNFα、IFN-γ)表達(dá)下調(diào)。以上發(fā)現(xiàn)提示PLCE1和PKCα在食管炎癥發(fā)展和食管上皮細(xì)胞惡變中發(fā)揮了重要作用。

HPV感染是重要的食管癌生物致病危險因素。Yang等[28]發(fā)現(xiàn)，PLCE1基因rs2274223位點SNP與HPV16感染有明顯互作關(guān)系；與攜帶rs2274223位點AA 基因型的HPV16血清陰性者相比，攜帶AA或AG基因型的 HPV16血清陽性者食管鱗癌患病風(fēng)險明顯升高。還有研究[28-29]發(fā)現(xiàn)PLCE1基因rs2274223位點SNP顯著增加了食管鱗癌患者對HPV感染的易感性。

這些研究結(jié)果提示“環(huán)境-遺傳-基因互作”模式是食管癌變的重要模式，PLCE1基因rs2274223位點可成為食管癌風(fēng)險評估的重要液體活檢標(biāo)志物,以此建立起聯(lián)合PLCE1基因的食管癌高危人群分子分型，可為食管癌高危人群篩查及早期發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)和新的思路。

3 PLCE1與PI-PLCE-NF-κB、PKCα/NF-κB和EGFR/PLCE1通路互作對食管癌變的影響

NF-κB信號通路在食管鱗癌發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。Li 等[30]的數(shù)據(jù)表明 NF-κB在食管鱗癌中被持續(xù)激活，參與食管鱗癌發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵步驟，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，抗凋亡和血管生成等。另兩項研究[31-32]也得出NF-κB在食管鱗癌中被持續(xù)激活的結(jié)論。表皮生長因子受體(EGFR)信號通路在食管癌的病理生理學(xué)中也起了關(guān)鍵作用。Kwak等[33]的研究結(jié)果提示EGFR通路與食管癌發(fā)生有關(guān)，EGFR突變可用于食管癌的分子分型。

PLCE1基因非同義SNP可能導(dǎo)致酶活性異常，最終引起功能改變，從而上調(diào)PLCE1 mRNA、蛋白的表達(dá)水平；PLCE1過表達(dá)的另一種可能機制是食管癌中PLCE1啟動子區(qū)CpG位點的低甲基化[34]。研究[34-35]證實PLCE1啟動子區(qū)低甲基化顯著上調(diào)了 PLCE1 蛋白的表達(dá)，后者通過PI-PLCE信號通路激活NF-κB，磷酸化激活p65和IκBα蛋白，磷酸化IκBα可促進(jìn)p50/p65的核易位。進(jìn)入細(xì)胞核的p65可以直接結(jié)合VEGF-C和Bcl-2基因的啟動子，增強VEGF-C和Bcl-2表達(dá)，從而增強血管生成、抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致食管癌的發(fā)生和發(fā)展。Chen等[36]觀察到低甲基化引起的PLCE1表達(dá)上調(diào)可以通過MDM2介導(dǎo)的蛋白酶體途徑促進(jìn)P53泛素化和去穩(wěn)定化，阻斷食管癌細(xì)胞的自噬，促進(jìn)食管癌的發(fā)生并導(dǎo)致預(yù)后不佳；表明PLCE1是MDM2和P53的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在MDM2-P53通路調(diào)節(jié)中有重要作用。PLCE1位于EGFR通路的下游，Wang等[37]的研究表明EGFR/PLCE1的遺傳變異可能是食管鱗癌術(shù)后預(yù)后的預(yù)測因子，具有PLCE1基因rs17109671位點和EGFR基因rs2072454位點CC基因型的個體應(yīng)該接受更積極的治療。Zhao等[38]發(fā)現(xiàn)PLCE1通過上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖，下調(diào)Caspase-3的表達(dá)，從而減少食管癌細(xì)胞凋亡。

綜上，PLCE1基因既是一個重要的易感基因，同時也具有致病基因的作用, 經(jīng)與PI-PLCE-NF-κB、PKCα/NF-κB和EGFR/PLCE1通路中多個基因相互作用(圖2～4)，促進(jìn)食管癌的發(fā)生和發(fā)展。

圖2 PLCE1-NF-κB-Ras/MAPK-P53通路

4 展望

越來越多的研究證明，“環(huán)境-遺傳-基因互作”是食管癌發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)。PLCE1及其介導(dǎo)的信號通路在食管癌發(fā)生和多階段演進(jìn)過程中的作用機制尚有待更多的研究闡明。環(huán)境致癌危險因素與PLCE1協(xié)同促進(jìn)慢性食管炎的發(fā)生和發(fā)展，并在此過程中引起其他相關(guān)基因和蛋白表達(dá)變化，最終導(dǎo)致食管上皮癌變。這一“環(huán)境-遺傳-基因互作”模式尚有待更多的人群隊列研究加以證明。這些復(fù)雜的互作機制為進(jìn)一步建立食管癌高危人群預(yù)警篩查和早期發(fā)現(xiàn)的液體活檢關(guān)鍵技術(shù)提供了重要候選指標(biāo)，并為食管癌靶向治療提供新的研究思路和策略。

圖3 PLCE1與Ras相互作用的3D蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

圖4 PLCE1與食管癌“環(huán)境-遺傳-基因互作”關(guān)系