孫振強，黨 欽，邵 博，趙陸洋，陳 壯，張 浩，袁維堂

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院結直腸肛門外科 鄭州 450052 2)鄭州大學醫(yī)學科學院 鄭州 450052 3)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

結直腸癌是全球第4位致死性癌癥，每年有近90萬患者死亡，患者確診時往往已處于晚期[1-2]。由于術后復發(fā)或轉移，結直腸癌患者的5 a生存率較低[3]。目前結直腸癌治療方法包括手術、術后輔助化療、放療、免疫治療和生物靶向治療等[2]，但由于治療效果不佳，患者生活質量及預后均不理想[4]。因此，積極尋找結直腸癌轉移標志物，對提高其早期診斷率和改善預后具有重要意義。

最近，環(huán)狀RNA成為癌癥研究的熱點，涉及腫瘤細胞增殖[5]、轉移[6]、血管生成[7]、腫瘤干細胞干性[8]和耐藥性[9]等。研究[10]表明，親本基因的表達與相應的環(huán)狀RNA的表達處于動態(tài)平衡中，兩者作用相反。在腫瘤的發(fā)展中，Zbtb7a基因的環(huán)狀RNA與其線性mRNA有相反的作用[11]。通過circBase數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA hsa_circ_0005019在結直腸癌中低表達，而其親本基因CHSY1能夠促進膠質母細胞瘤[12]、腎透明細胞癌[13]及結直腸癌[14]的進展。本研究探索了hsa_circ_0005019在結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移中的作用及對患者預后評估的價值，以期發(fā)現(xiàn)新的生物學標志物用于結直腸癌治療靶點的選取和預后評估。

1 材料與方法

1.1 材料人結腸癌細胞系HCT116購自中國科學院上海細胞生物學研究所。66對結直腸癌原發(fā)灶組織(多位點取樣)和匹配的距原發(fā)灶3 cm以上的癌旁正常腸黏膜組織均取自鄭州大學第一附屬醫(yī)院2016年11月至2020年12月的手術切除標本。病例入選標準：無術前化療、放療或靶向治療；不合并其他類型腫瘤；無自身免疫性疾病。66例中男36例，女30例，年齡22～82歲，其中≥60歲者34例。病理學分級：Ⅰ、Ⅱ級42例，Ⅲ、Ⅳ級24例；TNM 分期[基于NCCN(2019)指南]：Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期25例；腫瘤類型：非黏液腺癌48例，黏液腺癌18例；浸潤深度：浸潤至肌層18例，漿膜層48例。術中獲得的標本立即液氮速凍，-80 ℃保存?；颊呔炇鹬橥鈺痉桨附?jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，編號為2019-KY-423。

1.2 HCT116細胞培養(yǎng)及分組HCT116細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清(Gibco公司)的高糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)，在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下孵育。hsa_circ_0005019特異性小干擾RNA(siRNA)及對照siRNA由銳博生物公司(中國廣州)設計并合成。6孔板內每孔約接種3×105個HCT116細胞,24 h細胞貼壁后分為2組，用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher公司)分別轉染hsa_circ_0005019 siRNA(siRNA組)和對照siRNA(陰性對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用RNAiso Plus試劑(TaKaRa公司)提取細胞中總RNA，評價RNA質量和完整性后使用cDNA反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)將1 μg RNA反轉錄為cDNA。使用基因組DNA(gDNA)提取試劑盒(TIANGEN公司)提取細胞中的gDNA。hsa_circ_0005019上游引物序列5’-GCACGACCACTACTTGGACA-3’，下游引物序列5’-CACCATTCTCCGAAGCACCT-3’；GAPDH上游引物序列5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；hsa_circ_0005019反向引物上游引物序列5’-GAAG GTGTGTCCGGAGGTTT-3’，下游引物序列5’-TGTC CAAGTAGTGGTCGTGC-3’。使用預混熒光染料(翌圣公司)進行擴增，反應體系(20 μL)：熒光染料10 μL，無酶水(TaKaRa公司) 6 μL，模板cDNA或gDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，40個循環(huán)；60 ℃退火30 s；最后60 ℃ 1 min，95℃ 1 s。采用2-ΔΔCt法計算hsa_circ_0005019的相對表達量。實驗重復3次。制備30 g/L的瓊脂糖凝膠，電泳產(chǎn)物于凝膠成像儀(Tanon公司)中曝光，觀察正、反向引物在cDNA和gDNA中的擴增情況。

1.3 沉默hsa_circ_0005019對HCT116細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響使用CCK-8試劑盒(Dojindo公司)評價細胞增殖能力。取HCT116細胞接種于96孔板，每孔約接種1.5×103個細胞，按1.2中分組分別轉染hsa_circ_0005019 siRNA和對照siRNA，每組5個復孔。收集培養(yǎng)12、24、48和72 h的細胞，向培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃下孵育2 h，測定450 nm處的吸光度(參比波長為570 nm)，用于評價細胞增殖能力。實驗重復3次。

使用Transwell小室(膜孔徑8 μm，Corning公司)評估HCT116細胞的遷移和侵襲能力。取HCT116細胞，按1.2中分組分別轉染hsa_circ_0005019 siRNA和對照siRNA。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集、消化HCT116細胞，制成細胞懸液，調整細胞密度為3×106個/mL，將100 μL細胞懸液加入上室，預先將含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(600 μL)加入下室。在不含有基質膠的情況下進行遷移試驗，并使用DMEM培養(yǎng)基稀釋5倍后的基質膠(Corning公司)(100 μL/孔于小室中孵育1 h)進行侵襲實驗。在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育72 h后，吸去上室和下室殘留培養(yǎng)基，加入600 μL 40 g/L 的多聚甲醛固定至少30 min，1 g/L 的草酸銨結晶紫染色液(Solarbio公司)染色30 min。用PBS洗滌3次后，用無菌棉簽輕輕擦拭小室孔膜，晾干。用型號為Olympus FV1000的共聚焦顯微鏡觀察并計數(shù)遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.4 結直腸癌和配對癌旁正常組織中hsa_circ_0005019表達水平的檢測采用Trizol試劑提取結直腸癌組織和配對癌旁正常腸黏膜組織中總RNA，反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行熒光定量PCR，測定組織中hsa_circ_0005019的表達，每個樣本重復3次。方法步驟同1.3。

1.5 hsa_circ_0005019表達對結直腸癌預后的影響選擇結直腸癌組織中hsa_circ_0005019表達水平的均值作為截斷值，將66例患者分為低表達組(<均值)和高表達組(≥均值)，繪制2組患者的K-M生存曲線?？偵嫫?OS)定義為從腹腔鏡下結直腸癌根治術后開始至死亡或隨訪結束時間。根據(jù)中國臨床腫瘤學會《結直腸癌診療指南(2020版)》中的隨訪表Ⅰ級推薦規(guī)范進行門診復查或電話隨訪等。隨訪截止日期是2020年12月31日。

1.6 統(tǒng)計學處理使用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。采用兩獨立樣本t檢驗比較siRNA組和陰性對照組HCT116細胞中hsa_circ_0005019表達水平，增殖、遷移、侵襲細胞數(shù)等指標的差異，采用配對t檢驗比較結直腸癌和配對癌旁正常腸黏膜組織中hsa_circ_0005019表達水平的差異。將性別、年齡、病理學分級、TNM分期、腫瘤類型、浸潤深度作為調整變量，hsa_circ_0005019表達(0=低表達，1=高表達)作為自變量納入Cox回歸模型，分析hsa_circ_0005019表達對結直腸癌患者預后(0=生存，1=死亡)的影響。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 陰性對照組和siRNA組細胞hsa_circ_0005019表達水平的比較siRNA組hsa_circ_0005019的相對表達量為(0.528±0.021)，低于陰性對照組(1.000±0.034)(t=23.190，P<0.001)。

2.2 陰性對照組和siRNA組細胞增殖、侵襲和遷移能力的比較細胞生長曲線見圖1。轉染12、24、48和72 h后，siRNA組細胞的增殖能力強于陰性對照組，侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)多于陰性對照組。見表1。

圖1 2組細胞的生長曲線

表1 陰性對照組和siRNA組侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)比較

2.3 結直腸癌和配對癌旁正常腸黏膜組織中hsa_circ_0005019表達水平的比較結直腸癌組織中hsa_circ_0005019的相對表達量為(0.759±0.063)，低于癌旁正常組織(1.000±0.082)(t配對=7.504，P<0.001)。此外，我們發(fā)現(xiàn)利用hsa_circ_0005019的反向引物在HCT116細胞的cDNA中擴增出了目的基因片段，而未觀察到該反向引物在gDNA中成功擴增出相應片段(圖2)。

圖2 hsa_circ_0005019正、反向引物的擴增結果

2.4 hsa_circ_0005019的表達對結直腸癌患者預后的影響66例患者中失訪12例(高表達組4例，低表達組8例)。生存分析結果(圖3)顯示，高、低表達組生存曲線差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.296，P=0.038)，高表達組預后更好。Cox回歸分析結果顯示，hsa_circ_0005019表達水平是結直腸癌預后的預測因素(HR=0.104，95%CI：0.013～0.854，P=0.035)。

圖3 高、低表達組生存曲線的比較

3 討論

結直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，癥狀多樣且發(fā)病年齡趨于年輕化[15]。結直腸癌患者就診時常伴有遠處轉移，預后較差[16]，因此，迫切需要探索新的靶向治療藥物。

越來越多的研究[17-19]指出，環(huán)狀RNA分子在結直腸癌中表現(xiàn)出至關重要的作用。據(jù)報道[17]，環(huán)狀RNA CIRS-7是影響結直腸癌患者總生存期和癌細胞轉移的獨立危險因素。也有報道[18]環(huán)狀RNA GLIS2可激活結直腸癌細胞中的NF-κB通路，誘導產(chǎn)生促炎趨化因子，通過募集白細胞觸發(fā)腫瘤相關炎癥。環(huán)狀RNA 001971可通過發(fā)揮競爭性內源性RNA的作用，解除miR-29c-3p對血管內皮生長因子的抑制作用，從而加速結直腸癌細胞的增殖、侵襲和血管生成[7]。環(huán)狀RNA ITGA7通過抑制Ras信號通路和促進ITGA7的轉錄，抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移能力[19]。Li等[20]的研究表明血液中hsa_circ_0001900、hsa_circ_0001178和hsa_circ_0005927含量的聯(lián)合應用比癌胚抗原能更可靠地區(qū)分結直腸癌和非結直腸癌患者。

我們前期利用生物信息學方法在circBase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了一種新的環(huán)狀RNA hsa_circ_0005019，其生物學功能目前尚未見報道。本研究結果顯示， hsa_circ_0005019在結直腸癌細胞中作為抑癌基因發(fā)揮作用，敲低其表達結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強。此外，與癌旁正常腸黏膜組織比較，結直腸癌組織中hsa_circ_0005019呈低表達；生存分析結果顯示hsa_circ_0005019高表達的結直腸癌患者預后更好；Cox回歸分析結果顯示，hsa_circ_0005019表達水平是結直腸癌預后的預測因素。以上結果均表明hsa_circ_0005019是一種新的抑癌因子，有望成為新的結直腸癌預后預測指標。

綜上所述，環(huán)狀RNA hsa_circ_0005019在結直腸癌的增生及轉移中扮演著抑癌角色，高表達者預后更好。hsa_circ_0005019在結直腸癌中的抑癌作用為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制提供了新的線索，hsa_circ_0005019有望成為結直腸癌的治療靶點和用于預后評估。