余春平，馬齊兵，許春芳，童雅琪

（武漢能邁科實(shí)業(yè)有限公司，湖北武漢 430000）

肉桂酸鉀是天然香料肉桂的衍生物，易溶于水、具有廣譜的抑菌性[1]，作為一種新型天然防腐劑被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、飼料、日化和食品等各個領(lǐng)域[2]。pH值呈酸性的果蔬和飲料常使用肉桂酸鉀作為香料防腐劑，可以在增加食品風(fēng)味的同時達(dá)到防腐目的[3]。然而，肉桂酸鉀在熱加工中的應(yīng)用研究尚少，本文以大腸桿菌和黑曲霉為受試菌，通過菌落計(jì)數(shù)的方式比較不同pH值和不同溫度處理?xiàng)l件下肉桂酸鉀與3種傳統(tǒng)防腐劑對大腸桿菌和黑曲霉的抑菌性強(qiáng)弱，并將幾種防腐劑應(yīng)用到醬牛肉保質(zhì)期研究中，為熱加工工業(yè)食品添加劑研究提供技術(shù)參考，為天然香料防腐劑提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌、黑曲霉，均由武漢能邁科實(shí)業(yè)有限公司微生物實(shí)驗(yàn)室提供；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，奧博星生物；LB瓊脂培養(yǎng)基，上海博微生物科技有限公司；苯甲酸鈉（E211）、雙乙酸鈉（SDA）、山梨酸鉀（E202），均購來自萬邦化工；肉桂酸鉀，武漢能邁科實(shí)業(yè)有限公司；冷凍牛肉，亞太中慧；檸檬酸，上海誠心化工有限公司；BBS-DDC超凈工作臺，歐萊博科學(xué)儀器；DGL-35B高壓蒸汽滅菌鍋，力辰儀器；FA1004電子天平，力辰儀器；DHP-360恒溫培養(yǎng)箱，永光明醫(yī)療儀器；SZ-93自動雙重純水蒸餾器，亞榮生化儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化培養(yǎng)

以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)菌，按照晏家友等[4]的實(shí)驗(yàn)方法活化菌株。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基根據(jù)產(chǎn)品說明書按比例配制。

1.2.3 菌懸液的制備

無菌操作下取適量菌落于100 mL生理鹽水中搖勻，得到大腸桿菌與黑曲霉懸液。使用計(jì)數(shù)板對菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，將上述菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至 1×105cfu·mL-1備用。

1.2.4 防腐劑溶液的配制

①用生理鹽水分別配制濃度為2%的苯甲酸鈉、雙乙酸鈉、山梨酸鉀和肉桂酸鉀溶液。②使用檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH值（4.0、4.5、5.0、5.5和6.0）備用。③將防腐劑的生理鹽水溶液分別置于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃條件下進(jìn)行熱處理30 min，冷卻后備用。

1.2.5 檢測平板制備

取1 mL菌液與1 mL經(jīng)不同處理的防腐劑溶液混勻于無菌培養(yǎng)皿中，傾入冷卻至45～50 ℃的無菌瓊脂培養(yǎng)基，每皿18 mL，使皿中終體積為20 mL，防腐劑終濃度為1‰，以1 mL生理鹽水為空白對照，輕輕搖動鋪平，冷卻凝固后在最適溫度下孵育24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。不同處理防腐劑抑菌率計(jì)算公式為

式中：I代表抑菌率，%；A代表空白對照組菌落總數(shù)，cfu；A0代表實(shí)驗(yàn)組菌落總數(shù)，cfu。

1.2.6 醬牛肉保質(zhì)期試驗(yàn)

根據(jù)楊艷萍等[5]的實(shí)驗(yàn)方法稍有改動制作醬牛肉，在熟制過程中以1‰的濃度加入肉桂酸鉀和3種傳統(tǒng)防腐劑，制作完成后真空包裝置于室溫儲藏，180 d后觀察測定醬牛肉中感官評價指標(biāo)和微生物指標(biāo)。

1.2.7 揮發(fā)性鹽基測定

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》（GB 5009.228—2016）方法測定醬牛肉中TVB-N。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對防腐劑抑菌性能的影響

肉桂酸鉀是肉桂酸的鉀鹽，在水溶液中肉桂酸根結(jié)合H+水解成具有強(qiáng)抑菌性的肉桂酸，因此，在酸性條件下肉桂酸鉀對大腸桿菌和黑曲霉具有較好的抑菌性能。由圖1可知，當(dāng)pH值為4.0時肉桂酸鉀和山梨酸鉀對大腸桿菌的抑菌率可達(dá)95%以上，苯甲酸鈉和雙乙酸鈉對大腸桿菌的抑菌率稍低，可達(dá)90%；隨著pH值的升高，幾種防腐劑的抑菌性均有不同程度減弱，當(dāng)pH值為6.0時，抑菌率均低于50%，其中雙乙酸鈉的抑菌率最低，此時肉桂酸鉀抑菌率在實(shí)驗(yàn)組中依然保持最高，約為43%。這說明偏中性條件下無論是天然香料抑菌劑還是傳統(tǒng)防腐劑對大腸桿菌的抑菌性均會受到極大影響，其中肉桂酸鉀對酸的依賴最小。

圖1 pH值對防腐劑抑制大腸桿菌性能的影響

由圖2可知，不同防腐劑對黑曲酶抑菌性的影響趨勢與大腸桿菌一致。pH值為4.0時各實(shí)驗(yàn)組抑菌率均大于90%，隨著pH值的升高，幾種防腐劑對黑曲霉的抑菌性逐步減弱，其中抑菌性受酸堿度影響最大的是苯甲酸鈉，表明苯甲酸鈉作為一種酸性防腐劑只有在偏酸性的條件下方可有效抑制黑曲霉。肉桂酸鉀對黑曲霉的抑菌作用在pH值為5.0時依然可觀，繼續(xù)調(diào)高pH值才會破壞肉桂酸鉀抑菌性，當(dāng)pH值為6.0時，肉桂酸鉀對黑曲霉的抑制率超過50%，與山梨酸鉀抑菌率相當(dāng)。

圖2 pH值對種防腐劑抑制黑曲霉性能的影響

2.2 溫度對防腐劑抑菌性能的影響

食品加工工業(yè)中常常會用到熱加工的處理方式，然而有的活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性不強(qiáng)，在熱脅迫下容易變性失活，極大地限制了防腐劑的使用范圍和應(yīng)用場景。本研究將4種經(jīng)不同溫度處理的防腐劑應(yīng)用到大腸桿菌和黑曲霉抑菌實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示。圖3中明顯可以看出肉桂酸鉀對大腸桿菌的抑菌性不隨溫度變化而變化，當(dāng)熱處理溫度升高到100 ℃時肉桂酸鉀對大腸桿菌依然保持良好的抑菌性。而其余3種傳統(tǒng)防腐劑的防腐抑菌性能在一定程度上均有所減弱，其中以苯甲酸鈉抑菌性隨溫度升高衰減最快，當(dāng)溫度升高到80 ℃，苯甲酸鈉對大腸桿菌的抑菌率僅為50%左右。當(dāng)溫度低于60 ℃時，3種防腐劑對大腸桿菌的抑菌性能強(qiáng)弱隨溫度變化影響不大，但當(dāng)溫度高于80 ℃苯鉀酸鈉、山梨酸鉀以及雙乙酸鈉對大腸桿菌的抑菌性大幅度減弱，表明在低溫?zé)峒庸み^程中4種防腐劑均能保持較好的生物活性，可以極大程度抑制大腸桿菌生長，但是溫度一旦高于80 ℃，僅有肉桂酸鉀可以保持良好抑菌活性，3種傳統(tǒng)防腐劑均不適用于熱加工工業(yè)中。

圖3 不同處理溫度對防腐劑抑制大腸桿菌性能的影響

由圖4可知，不同處理溫度對4種防腐劑抑黑曲霉性能的影響與圖3一致。肉桂酸鉀的熱穩(wěn)定性極佳，其對大腸桿菌和黑曲霉的抑菌作用幾乎不受處理溫度的影響。苯甲酸鈉、雙乙酸鈉和山梨酸鉀這3種傳統(tǒng)防腐劑在20 ℃低溫處理時對黑曲霉的抑菌作用略低于肉桂酸鉀，隨著溫度升高，3種傳統(tǒng)防腐劑對黑曲霉的抑菌性逐漸減弱，雙乙酸鈉在100 ℃時的抑菌率最低。當(dāng)處理溫度為60 ℃時，雙乙酸鈉對黑曲霉的抑菌率約為50%左右；當(dāng)處理溫度為100 ℃時雙乙酸鈉、苯甲酸鈉以及山梨酸鉀對黑曲霉的抑菌率僅為30%左右。

圖4 不同處理溫度對防腐劑抑制黑曲霉性能的影響

綜上，與3種傳統(tǒng)防腐劑相比，肉桂酸鉀對熱脅迫具有較好的耐受性，其對大腸桿菌和黑曲霉的抑菌性能幾乎不受處理溫度的影響，這可能是因?yàn)槿夤鹚徕浫∽蕴烊幌懔先夤穑夤鹁哂懈邷佧u煮特性，活性成分穩(wěn)定，不易失活變性。

2.3 防腐劑對醬牛肉感官評價的影響

由表1可知，苯甲酸鈉組和雙乙酸鈉組脹袋且產(chǎn)生異味，已經(jīng)發(fā)生明顯變質(zhì)；此時山梨酸鉀組未脹袋，有濃郁的肉香味，顏色正常，質(zhì)構(gòu)完整，但是肉質(zhì)失去咀嚼特性，即將腐敗變質(zhì)；肉桂酸鉀處理組一切正常，咀嚼特性良好，產(chǎn)品依然處于最佳品嘗期。出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象或許與肉桂酸鉀良好的熱穩(wěn)定性有關(guān)，在鹵煮階段加入防腐劑有利于防腐劑向食品內(nèi)部均勻擴(kuò)散，有助于延長產(chǎn)品保質(zhì)期。然而，不耐高溫型防腐劑的加入不能起到有效的防腐抑菌目的，因此在醬牛肉的防腐過程中肉桂酸鉀較傳統(tǒng)防腐劑具有顯著性優(yōu)勢。

表1 室溫儲藏180 d后醬牛肉感官評價

2.4 防腐劑對醬牛肉中微生物的影響

高溫醬鹵結(jié)束后直接測定各實(shí)驗(yàn)組菌落總數(shù)為第0天微生物檢測指標(biāo)，各組原始菌落數(shù)相同，在保藏過程中每隔30 d進(jìn)行微生物檢測。由表2可知，肉桂酸鉀防腐組在前150 d微生物檢測中均未見菌落生長，在第180天肉桂酸鉀防腐實(shí)驗(yàn)組菌落總數(shù)為（24±5）cfu·g-1，此時醬牛肉尚未變質(zhì)。因此本實(shí)驗(yàn)將180 d作為肉桂酸鉀應(yīng)用于醬牛肉中的保質(zhì)期。同理，雙乙酸鈉應(yīng)用醬牛肉的保質(zhì)期為60 d，苯甲酸鈉對醬牛肉的保質(zhì)期為90 d，山梨酸鉀為150 d，而空白對照組（不添加任何防腐劑的醬牛肉）保質(zhì)期＜30 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肉桂酸鉀可以延長醬牛肉的保質(zhì)期，且添加肉桂酸鉀的實(shí)驗(yàn)組保質(zhì)期明顯長于3種傳統(tǒng)防腐劑，該結(jié)果與2.3中感官評價結(jié)論一致。此外，肉桂酸鉀熱穩(wěn)定性好，在鹵煮過程中添加防腐劑的方式不會破壞其生物活性，還有利于抑菌活性成分肉桂酸向食品內(nèi)部擴(kuò)散，從而延長肉制品保質(zhì)期至180 d。

表2 不同防腐劑對醬牛肉中微生物的影響

2.5 防腐劑對醬牛肉中TVB-N的影響

不用防腐劑處理的醬牛肉在室溫保藏180 d后，肉制品中揮發(fā)性鹽基氮TVB-N含量變化如圖5所示。揮發(fā)性鹽基氮TVB-N可以指示食品中氨基酸是否發(fā)生腐敗變質(zhì)，TVB-N含量越低，食品腐敗程度越低，意味著肉質(zhì)越新鮮。在室溫保存180 d后空白對照組醬牛肉樣本中TVB-N含量最高，表明此時空白對照組已經(jīng)發(fā)生變質(zhì)，防腐處理組TVB-N含量相對較低，其中肉桂酸鉀防腐處理組最低，表明肉桂酸鉀在180 d室溫保存中可以有效降低醬牛肉中氨基酸被破壞程度，使肉質(zhì)保持新鮮可食狀態(tài)。

圖5 防腐劑對醬牛肉TVB-N的影響

3 結(jié)論與討論

本研究通過探究肉桂酸鉀與3種傳統(tǒng)防腐劑受酸脅迫和熱脅迫條件下的穩(wěn)定性比較。發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉、雙乙酸鈉、山梨酸鉀以及肉桂酸鉀等防腐劑均在酸性條件下對大腸桿菌和黑曲霉具有較好的抑菌性能，當(dāng)pH值低至4.0時4種防腐劑對大腸桿菌和黑曲霉的抑菌率均可達(dá)90%。當(dāng)pH值升高時幾種防腐劑的抑菌性均出現(xiàn)不同程度減弱，當(dāng)pH值為6.0時僅肉桂酸鉀可以保持50%左右抑菌率，較其他防腐劑對環(huán)境pH值的適應(yīng)性更強(qiáng)。同時，肉桂酸鉀具有較好的熱穩(wěn)定性，其對大腸桿菌和黑曲霉的抑菌性幾乎不隨溫度升高而變化，反觀傳統(tǒng)防腐劑雙乙酸鈉等在熱處理過程中無法有效保持抑菌活性，極大地限制了這類防腐劑的使用范疇。將幾種防腐劑應(yīng)用到醬牛肉防腐保鮮中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有良好熱穩(wěn)定性的天然香料防腐劑肉桂酸鉀在鹵煮過程中加入可以有效抑制醬牛肉中氨基酸腐敗變質(zhì)生成揮發(fā)性鹽基氮，且可以保持醬牛肉較好的感官風(fēng)味與口感，延長醬牛肉保質(zhì)期。本研究為食品熱加工工業(yè)防腐保鮮提供研究樣本，為天然香料防腐劑的開發(fā)應(yīng)用擴(kuò)寬新的思路。