時小紅 文乾鈞 彭茜茜

1 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

2 杭州市第一人民醫(yī)院 浙江 杭州 310003

3 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer，ROU）是一種以口腔黏膜炎性反應(yīng)或增生為病理特征的口腔疾病。菌群紊亂誘發(fā)ROU的病理機(jī)制已成為近5年新的研究方向。本研究以舌苔微生態(tài)菌群為對象闡述菌群參與ROU的病變機(jī)理，有望闡明ROU的發(fā)病新機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象：40例受試者中，20例ROU確診者為杭州市第一人民醫(yī)院2017年9月至2018年12月納入的患者，20例健康者為浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)生。20例ROU患者符合入組標(biāo)準(zhǔn)，男性10人，女性10人，1人用藥前后標(biāo)本采集結(jié)束后一般資料缺失；平均年齡35.4歲；入組初期行癥狀分級量化、癥狀自評量表SCL-90[1]心理健康測試調(diào)查問卷測評。本研究得到杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。受試者簽署知情同意書，ROU癥狀分級量化評分、心身癥狀自評量表積分等參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》和相關(guān)文獻(xiàn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照3版《口腔內(nèi)科學(xué)》教材和《實用口腔學(xué)》，復(fù)發(fā)性口瘡診斷標(biāo)準(zhǔn)和分型標(biāo)準(zhǔn)：①輕型口瘡：潰瘍小而淺，數(shù)目少，1～3個，1～2mm大小，紅腫不著，邊緣整齊有紅暈，基底稍凹平坦，一般7～10天愈合，愈合不留疤痕。②口炎性口瘡：又稱皰疹性口瘡，潰瘍表淺平坦形狀不規(guī)則，可由小米粒大小到蠶豆大小，數(shù)目多可達(dá)數(shù)十個，可互相融合，有黃色滲出，周圍充血明顯，范圍大，疼痛明顯。③腺周口瘡：又稱巨型口瘡，潰瘍大而深，成彈坑狀，潰瘍面積可達(dá)1cm以上，常孤立發(fā)生，亦可同時發(fā)生數(shù)個，邊緣高起明顯，充血不著或顯黯紅，病程長，愈合緩慢，可達(dá)1個月至數(shù)月，愈合后留有疤痕。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。②根據(jù)各期臨床試驗?zāi)康囊约氨静√攸c，確定合理的納入病程。③注意合理的受試年齡。④簽署進(jìn)入研究知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合中醫(yī)或西醫(yī)復(fù)發(fā)性口瘡診斷的非復(fù)發(fā)性口瘡，如創(chuàng)傷性潰瘍、癌性潰瘍、感染性口炎、白塞病及其他潰瘍者。②意向妊娠或孕婦、哺乳期婦女。③過敏體質(zhì)和對多種藥物過敏者。④合并心血管、腦血管、肝腎系統(tǒng)和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病或精神病患者。

1.5 復(fù)方中藥干預(yù)方法：根據(jù)ROU診治方案，給予ROU組自擬方愈瘍湯（金銀花20g、人中白10g、木芙蓉15g等）為基礎(chǔ)方干預(yù)。本研究所用藥物均為飲片制劑（江陰天江藥業(yè)生產(chǎn)），按照《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定范圍內(nèi)劑量執(zhí)行制定處方；水煎服，2次/日，臨床干預(yù)7天。治療1周，收集舌苔樣本備用。3個月、6個月時隨訪。

1.6 樣本采集：共收集舌苔樣本60例，其中ROU組治療前采樣20例、治療后采樣20例，健康對照組采樣20例。舌苔樣本采集方法：使用拭子刮取，樣本從舌背中部開始，從后向前刮3次，刮取舌中心1cm2的部位，約5s。立即在含有750μL的MoBio buffer中渦旋。拭子上的海綿應(yīng)該在離心管壁多按壓幾次，約20s，以確保將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到buffer中。然后將buffer在-80℃冷凍保存，直到開始實驗。

1.7 實驗流程：具體如下。

1.7.1 基因組DNA和RNA抽提：使用TriZol方法同時提取樣本RNA和DNA。

1.7.2 宏基因組測序及分析方法：使用Illumina MiSsq 16S rRNA測序試劑盒，測序16S RNA V3-V4區(qū)間550bp序列，并得到樣本宏基因組文庫。

1.7.3 RNA測序：對ROU組、健康對照組的RNA進(jìn)行測序，并使用DEGUST篩選出顯著改變表達(dá)的基因。

1.7.4 統(tǒng)計學(xué)處理：采用描述性方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

基于門屬水平的各組測試者舌苔微生物構(gòu)成的研究結(jié)果，具體如下。

2.1 物種構(gòu)成：根據(jù)物種注釋結(jié)果，統(tǒng)計每個樣品在界（kingdom）、門(phylum)、綱(class)、目 (order)、科(family)、屬(genus)、種(species)水平上的序列數(shù)目，由此可以了解各分類水平整體注釋情況。樣品中生物多樣性信息，經(jīng)比對后獲得分類操作單元（OTU）為171。各樣品在細(xì)菌各分類水平上具較大差異，提示口腔潰瘍患者與健康測試者之間以及使用愈瘍湯干預(yù)與否等因素可導(dǎo)致腸道菌群產(chǎn)生顯著變化。

2.2 物種分類：本研究采用同源性序列比對聚類等方法，將所有的序列鑒定為8個門。厚壁菌門，研究發(fā)現(xiàn)肥胖與兩種主要的細(xì)菌（擬桿菌門和厚壁菌門）豐度相關(guān)；肥胖菌群具有增加從食物中獲得能量的能力[2]。變形菌門，有研究發(fā)現(xiàn)上千個隨個體顯著、持續(xù)變化的基因，這些可變基因和變形菌門有關(guān)[3]。梭桿菌門，可作為潛在的標(biāo)志物用于ROU診斷和預(yù)后評估，也是治療ROU的潛在靶點。放線菌門，可產(chǎn)生維生素、抗生素，復(fù)方中藥通過調(diào)節(jié)此類菌群而實現(xiàn)免疫功能的提升并成為復(fù)方中藥重要作用機(jī)制。螺旋菌包括幽門螺桿菌在內(nèi)的彎曲菌和螺旋菌。典型致病菌為幽門螺桿菌，通過酸堿平衡失調(diào)，酸增多腐蝕正常組織，導(dǎo)致潰瘍經(jīng)久不愈，甚至細(xì)胞異生，癌變。

2.3 復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者的舌苔菌群變化：ROU組治療前與健康對照組比較，28個OTU水平下降，43個OUT水平升高，并具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。ROU組治療后與健康對照組比較，31個OTU水平升高，140個OUT下降，并具統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。ROU組治療前后比較，治療后3個OTU水平升高，2個OUT水平下降，并具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

在應(yīng)激、焦慮、抑郁時癥狀易復(fù)發(fā)是筆者前期臨床研究結(jié)果的一部分[4]。多項研究證實，口腔疾病患者舌苔微生態(tài)菌群結(jié)構(gòu)與健康人存在差異。如李偉等［5］發(fā)現(xiàn)萎縮性舌炎患者舌苔中致病菌菌落數(shù)量明顯增多。由于舌自潔能力的減弱，引起舌苔微生物的異常變化，加重了患者本身的感染。朱振亞[6]證實復(fù)發(fā)性口腔潰瘍與患者口腔微生物菌群變化有顯著相關(guān)性。有研究者在ROU患者的病損部位分離并培養(yǎng)出了L型鏈球菌，且發(fā)現(xiàn)其繁殖周期與口腔潰瘍的復(fù)發(fā)周期相一致，說明口腔常見菌群（鏈球菌、韋榮菌）的變化與ROU的發(fā)病可能存在一定的相關(guān)性[7]。

目前認(rèn)為單味或復(fù)方中藥對于微生態(tài)菌群的干預(yù)，可能通過改變菌群的組成，改善菌群失調(diào)等來實現(xiàn)。菌群可能將草藥中的化學(xué)成分轉(zhuǎn)化為有不同生物活性/毒性及不同生物利用度的代謝產(chǎn)物[8]。中藥的作用靶點有可能是腸道菌群，通過多藥配伍組合促進(jìn)腸道微生態(tài)等共生菌從病理狀態(tài)向生理狀態(tài)切換，從而表現(xiàn)出良好的慢病治療效果[9-11]。

縱向上，舌苔類群之間的相關(guān)性可能表明舌苔細(xì)菌之間的協(xié)同或拮抗作用。健康個體仍然擁有支持疾病相關(guān)細(xì)菌的生態(tài)組成。與病原微生物相容的健康轉(zhuǎn)移是由于病原菌的比例增加，而不是由于先前健康個體中的疾病相關(guān)細(xì)菌的重新定植。通過有效地減少舌苔和周圍環(huán)境中病原體的相對豐度來降低感染的概率，有效地控制舌苔中病原體的相對豐度，對于治療后的患者來說更為重要[12]。