郭 誠(chéng) 葉方雄 楊雪雁 李 威 萬雨涵 楊定平

腎臟是膿毒癥中最脆弱的器官之一,由膿毒癥引起的急性腎損傷預(yù)后較差[1-2]。然而,膿毒癥相關(guān)急性腎損傷(SA-AKI)的病理生理機(jī)制尚不清楚,目前尚無有效的治療策略。最近研究表明,線粒體功能障礙在SA-AKI發(fā)病中起重要作用[3-6]。

線粒體是氧化磷酸化產(chǎn)生高能三磷酸腺苷(ATP)的主要場(chǎng)所,也是活性氧(ROS)產(chǎn)生的部位。此外,線粒體還參與調(diào)節(jié)膜電位、調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和增殖、調(diào)節(jié)鈣信號(hào)、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。腎線粒體功能障礙發(fā)生在膿毒癥早期,與ROS產(chǎn)生有直接關(guān)系[7]。

解偶聯(lián)蛋白(UCP)是線粒體內(nèi)膜蛋白,其主要功能是將線粒體的ATP合成與電子傳遞解偶聯(lián),與消散質(zhì)子梯度有關(guān)[8-10]。哺乳動(dòng)物中有5種UCP,即UCP1～5,其中UCP2廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞類型,包括腎小管細(xì)胞[11]。UCP2在控制線粒體產(chǎn)生ROS方面起著關(guān)鍵作用[12-13],對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。此外,UCP2還參與控制其他生理和病理過程,包括神經(jīng)退化、葡萄糖代謝、脂肪酸氧化能力對(duì)饑餓的適應(yīng)、炎癥反應(yīng)和自噬。最近研究表明[14-15],通過上調(diào)UCP2的表達(dá)可減少ROS生成,減輕腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[16],對(duì)SA-AKI有保護(hù)作用。

鳶尾素是由纖維連接蛋白Ⅲ型含結(jié)構(gòu)域蛋白5(FNCD5)釋放的一種免疫調(diào)節(jié)性脂肪肌肉因子,參與線粒體的生物合成和氧化代謝。大量研究證實(shí)FNCD5過表達(dá)或補(bǔ)充鳶尾素可以保護(hù)線粒體功能,減輕氧化損傷和細(xì)胞凋亡[14-15,17-19]。然而,鳶尾素對(duì)SA-AKI的保護(hù)作用仍不清楚。本研究采用脂多糖(LPS)腹腔注射誘導(dǎo)的小鼠SA-AKI模型來驗(yàn)證這一假說。

材料與方法

對(duì)象和分組6～8周齡雄性C57BL/6小鼠,安置在12 h的光/暗周期中。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成,并經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):IACUC Issue No.20211103)。

為探討鳶尾素在SA-AKI中的作用,將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組和實(shí)驗(yàn)組(LPS+鳶尾素組)。實(shí)驗(yàn)組在腹腔注射LPS 10 mg/kg,前14 d連續(xù)腹腔注射重組鳶尾素100 μg/kg(Novoprotein,中國(guó)深圳)。對(duì)照組給予等體積生理鹽水。此外,鳶尾素的用量是根據(jù)先前的一項(xiàng)研究確定的[18]。腹腔注射LPS或等體積生理鹽水24 h后,以0.05 mg/g戊巴比妥鈉腹腔注射處死小鼠,并采集血液和腎臟標(biāo)本。

腎近端小管上皮細(xì)胞(HK-2)的培養(yǎng)與處理HK-2購自武漢華聯(lián)生物科技有限公司。在含5%胎牛血清(FBS)和1%青霉素鏈霉素的Dulbecco‘s Modified Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)/F12(美國(guó)Gibco)中,37°C,5% CO2溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),用LPS孵育8 h,建立膿毒癥模型。

為探討鳶尾素的作用機(jī)制,在LPS孵育前分別用重組鳶尾素5 μmol/L和10 μmol/L處理細(xì)胞12 h和18 h。另外,部分細(xì)胞在加入鳶尾素之前先用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制劑:化合物C(5 μmol/L,Sigma-Aldrich)預(yù)處理8 h。

腎功能評(píng)價(jià)血液樣本凝結(jié)后,離心獲得血清,分別測(cè)定尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)濃度,評(píng)價(jià)腎功能。

腎小管損傷評(píng)價(jià)腎組織用10%福爾馬林固定,石蠟包埋,制備厚度為3 μm,蘇木精-伊紅(HE)染色。腎小管損傷情況由兩名有經(jīng)驗(yàn)的腎臟病理研究人員盲法評(píng)估。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分,腎小管損傷<10%;1分,腎小管損傷10%～25%;2分,腎小管損傷25%～50%;3分,腎小管損傷50%～75%;4分,腎小管損傷>75%。隨機(jī)選擇至少10個(gè)部分,計(jì)算平均分。

WesternBlotting(WB)檢測(cè)蛋白質(zhì)水平腎組織用RIPA裂解緩沖液收集蛋白質(zhì)。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶封閉后,用以下一抗在4 ℃孵育過夜:UCP2、bcl-2原癌基因的編碼蛋白(Bcl-2)、激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(c-caspase-3)、Bcl-2樣蛋白4(Bax)、白細(xì)胞介素(IL)1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、腎損傷分子1(KIM-1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1:3 000稀釋度)在37 ℃孵育1 h,每步洗滌3次,每次10 min。最后,使用化學(xué)發(fā)光ECL試劑盒(Bio-Rad,USA)檢查這些膜并由Image Lab 5.2.1掃描。蛋白表達(dá)歸一化為GAPDH表達(dá)。

ELISA檢測(cè)炎癥因子水平利用武漢賽培生物科技公司提供的小鼠IL-1β(SP12667)、IL-6(SP13755)和TNF-α(SP13726)ELISA試劑盒定量測(cè)定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。根據(jù)試劑盒說明,將血清標(biāo)本和生物素偶聯(lián)劑加入到抗體預(yù)涂布孔中。然后加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)劑和TMB底物。用熒光微板閱讀器在450 nm處用分光光度法測(cè)量黃色的強(qiáng)度。

TUNEL檢測(cè)腎組織中細(xì)胞凋亡石蠟切片按TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(南京KeyGen Biotech,江蘇)制作,細(xì)胞核用DAPI(Boster,武漢)染色。用立式熒光顯微鏡觀察每切片10個(gè)隨機(jī)區(qū)域,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),進(jìn)行凋亡細(xì)胞的相對(duì)定量。

實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)分析用TRIzol試劑從HK-2細(xì)胞中提取總RNA,隨后使用轉(zhuǎn)錄器第一鏈cDNA合成試劑盒(羅氏,巴塞爾,瑞士)將該mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用LightCycler 480SYBR Green 1 Master Mix(羅氏,巴塞爾,瑞士)進(jìn)行RT-qPCR分析基因表達(dá)。引物由高原生物醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所(中國(guó)北京)合成,引物序列為:FNDC5(F:5’-AGCTCAGAAGTAGAATGCGAGAG-3’;R:5’-GGTGATAGGAAGATGGTGGTGGT-3’)AMPK(F:5’-GGGCACCTGTGGTGCTACCTG-3’;R:5’-ATGAGCTTTGCCTCCGTCCGC-3’)UCP2(F:5’-CACCTTCGGCAAAGTGAAGA-3’;R:5’-TCTTCAACCCTCCCGTGTTT-3’)GAPDH(F:5’-AGACAGCCGCTTCTTGT-3’;R:5’-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3’)。

熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平用2‘,7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)和二氫乙錠(DHE)測(cè)定HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平。DHE(Beyotime,中國(guó),上海)用于超氧陰離子染色,DCFH-DA(Beyotime,上海,中國(guó))用于評(píng)估過氧化氫(H2O2)含量。在相同條件下采集圖像,并使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Controbernetics,MD,USA)對(duì)各組的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化以進(jìn)行結(jié)果比較。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用《GraphPad Prism 8》軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)。多組間比較分析采用單因素方差分析,然后進(jìn)行后LSD檢驗(yàn)。采用Spearman’s分析評(píng)價(jià)兩因素間的相關(guān)性。本研究所有測(cè)量數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

鳶尾素顯著改善SA-AKI的腎損傷C57BL/6小鼠腎經(jīng)LPS處理后BUN和SCr顯著升高。在給鳶尾素后,小鼠的腎功能明顯減輕,表現(xiàn)為BUN和SCr水平顯著下降。WB檢測(cè)SA-AKI中KIM-1的表達(dá),與對(duì)照組相比,LPS組KIM-1水平升高,然而,在補(bǔ)充鳶尾素后,SA-AKI小鼠中KIM-1的表達(dá)顯著降低。用HE染色觀察各組SA-AKI小鼠腎臟損傷情況,與對(duì)照組相比,LPS組腎小管損傷評(píng)分水平升高,在補(bǔ)充鳶尾素后,能顯著改善腎損傷,降低損傷評(píng)分(圖1)。

圖1 各組小鼠腎功能、腎組織腎小管損傷評(píng)分和腎組織蛋白提取物KIM-1濃度CON:對(duì)照組;LPS:脂多糖處理組;LPS+IRISIN:脂多糖和鳶尾素處理組;BUN:血尿素氮;SCr:血清肌酐;KIM-1:腎損傷分子1;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;A:各組小鼠BUN濃度;B:各組小鼠SCr濃度;C:腎組織蛋白提取物KIM-1水平;D:腎臟病理圖片(HE,×400);E:腎小管損傷評(píng)分的定量分析;F:腎組織蛋白提取物KIM-1水平及內(nèi)參GAPDH的Western Blotting檢測(cè);**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

鳶尾素顯著改善SA-AKI的炎癥反應(yīng)小鼠血清和腎組織中的炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的水平在LPS組較對(duì)照組明顯升高。同時(shí),經(jīng)過鳶尾素處理后的實(shí)驗(yàn)組炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)較LPS組明顯下降(圖2)。

圖2 腎組織蛋白提取物和血清炎癥因子的濃度CON:對(duì)照組;LPS:脂多糖處理組;LPS+IRISIN:脂多糖和鳶尾素處理組;IL-6:白細(xì)胞介素6;IL-1β:白細(xì)胞介素-1β;TNF-α:腫瘤壞死因子α;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;A:腎組織炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)及內(nèi)參GAPDH的Western Blotting檢測(cè);B～D:腎組織炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的Western Blotting檢測(cè)結(jié)果分析;E～G:血清炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的ELISA結(jié)果分析;*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1

圖3 腎組織蛋白提取物中凋亡因子濃度和腎組織細(xì)胞凋亡水平CON:對(duì)照組;LPS:脂多糖處理組;LPS+IRISIN:脂多糖和鳶尾素處理組;Bcl2:Bcl-2原癌基因編碼蛋白;c-caspase3:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3;Bax:Bax蛋白;A:凋亡因子(Bcl2、c-caspase3、Bax)及內(nèi)參GAPDH的Western Blotting檢測(cè);B～D:凋亡因子(Bcl2、c-caspase3、Bax)及內(nèi)參GAPDH的Western Blotting檢測(cè)結(jié)果分析;E:腎組織中TUNEL檢測(cè)的代表性圖像;F:腎臟中TUNEL染色陽性細(xì)胞的比；**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

圖4 腎組織蛋白提取物中UCP2、AMPK和P-AMPK的濃度CON:對(duì)照組;LPS:脂多糖處理組;LPS+IRISIN:脂多糖和鳶尾素處理組;UCP2:解偶聯(lián)蛋白2;AMPK:AMP依賴的蛋白激酶;P-AMPK:磷酸化AMPK;A、B:細(xì)胞中UCP2及內(nèi)參GAPDH的Western Blotting檢測(cè)結(jié)果分析;C、D:各組胞中AMPK、P-AMPK的Western Blotting檢測(cè)和結(jié)果分析；*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1；NS:無顯著差異

鳶尾素顯著改善SA-AKI的細(xì)胞凋亡腎小管細(xì)胞凋亡是SA-AKI的一個(gè)重要病理特征,通過分析caspase 3的激活和TUNEL法來檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。WB檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,LPS組c-caspase-3、Bax激活明顯,Bcl-2受到明顯抑制,然而,在鳶尾素預(yù)處理后,SA-AKI小鼠中c-caspase-3、Bax的激活顯著降低,Bcl-2 水平恢復(fù)(圖3A～D)。此外,TUNEL檢測(cè)顯示同樣的結(jié)果(圖3E、F),在LPS損傷前,經(jīng)鳶尾素預(yù)處理后的小鼠,凋亡細(xì)胞比例明顯降低。

鳶尾素上調(diào)SA-AKI中UCP2和AMPK通過WB檢測(cè)分析各組小鼠腎組織蛋白提取物中UCP2和AMPK蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比,LPS組UCP2和AMPK蛋白表達(dá)明顯增加,經(jīng)鳶尾素預(yù)處理后,UCP2和AMPK蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加(圖4)。

鳶尾素顯著改善SA-AKI的氧化應(yīng)激在體外,用LPS孵育HK-2細(xì)胞,建立膿毒癥模型。DHE/DCFH-DA熒光染色(圖5A)所示,與對(duì)照組相比,LPS組ROS和H2O2水平明顯升高。然而,與LPS組相比,經(jīng)過鳶尾素預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組顯著降低了細(xì)胞中ROS和H2O2水平(圖5B)。

圖5 HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平(DHE/DCFH-DA熒光染色)CON:對(duì)照組;LPS:脂多糖處理組;HK-2:腎近端小管上皮細(xì)胞;LPS+IRISIN:脂多糖和鳶尾素處理組;A:HK-2細(xì)胞DHE/DCFH-DA熒光染色的圖片,比例尺=40 μm;B:HK-2細(xì)胞ROS熒光檢測(cè)結(jié)果分析;****P<0.000 1

鳶尾素調(diào)控的UCP2表達(dá)可能與AMPK的激活有關(guān)利用RT-qPCR技術(shù)測(cè)定各組HK-2細(xì)胞中FNCD5 mRNA 、AMPK mRNA、 UCP2 mRNA的水平。對(duì)照組與LPS組兩者之間無顯著差異,說明LPS刺激不會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性FNCD5含量增加。經(jīng)過鳶尾素處理后,FNCD5 mRNA水平升高,而且不受化合物C影響,說明鳶尾素不受AMPK抑制劑的影響(圖6A)。與對(duì)照組相比,鳶尾素處理的HK-2細(xì)胞具有明顯的AMPK激活和UCP2表達(dá)。但是,用AMPK抑制劑化合物C預(yù)處理可明顯抑制鳶尾素對(duì)AMPK和UCP2水平的影響(圖6B、C)。

為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論,采用不同時(shí)間點(diǎn)和不同劑量鳶尾素預(yù)處理HK-2細(xì)胞。加大鳶尾素劑量和延長(zhǎng)處理時(shí)間均可導(dǎo)致AMPK和UCP2水平升高,表明鳶尾素和AMPK及UCP2之間存在線性關(guān)系(圖6D、E)。

圖6 HK-2細(xì)胞中FNCD5、UCP2和AMPK mRNA濃度CON:對(duì)照組;LPS:脂多糖處理組;LPS+IRISIN:脂多糖和鳶尾素處理組;LPS+IRISIN+CC:脂多糖、鳶尾素和化合物C處理組;FNCD5:纖維連接蛋白Ⅲ型含結(jié)構(gòu)域蛋白5;UCP2:解偶聯(lián)蛋白2;AMPK:AMP依賴的蛋白激酶;A～C：細(xì)胞中FNCD5 mRNA 、AMPK mRNA和UCP2mRNA的含量 (RT-qPCR)；D、E：鳶尾素處理后HK2細(xì)胞AMPK mRNA和UCP2 mRNA (RT-qPCR)的變化；*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1；NS:無顯著差異

討 論

在膿毒癥期間,腎小管上皮細(xì)胞表現(xiàn)出氧化應(yīng)激、ROS的產(chǎn)生和線粒體損傷的增加,線粒體功能障礙在SA-AKI發(fā)展中起關(guān)鍵作用,因此,改善和保護(hù)線粒體功能成為SA-AKI治療研究的重點(diǎn)。UCP2是一種位于線粒體內(nèi)膜上的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在控制線粒體產(chǎn)生活性氧方面起著關(guān)鍵作用[12-13]。

在本研究中,我們選擇了經(jīng)典的LPS誘導(dǎo)的AKI模型,并通過腹腔注射鳶尾素來研究鳶尾素在SA-AKI進(jìn)展中的作用。通過對(duì)腎功能、腎小管損傷、各種促炎細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平的對(duì)比檢測(cè),證實(shí)LPS成功造模后小鼠的腎功能明顯惡化,腎小管損傷加重,促炎細(xì)胞因子增多,氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡顯著增加。同時(shí)也證實(shí)了鳶尾素能明顯改善SA-AKI模型腎功能和小管上皮的損傷,抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和KIM-1的表達(dá),降低氧化應(yīng)激和凋亡水平。此外,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)鳶尾素對(duì)SA-AKI的保護(hù)作用可能至少部分與激活A(yù)MPK/UCP2信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,鳶尾素通過上調(diào)線粒體UCP2的表達(dá)在SA-AKI過程中起保護(hù)作用。因此,鳶尾素是一種針對(duì)LPS誘導(dǎo)的AKI的潛在治療劑。此外,本研究主要研究鳶尾素對(duì)SA-AKI中UCP2的影響,其他機(jī)制和數(shù)據(jù)還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和研究。