查宏楚 朱杰夫 師 朗 夏 瑤 李惠敏 宋志霞

急性腎損傷(AKI)是較為常見的嚴重臨床綜合征,其主要臨床特征是腎功能在短期內(nèi)下降導(dǎo)致體內(nèi)肌酐和尿素等含氮廢物蓄積。據(jù)統(tǒng)計,AKI每年造成約200萬人死亡,且部分存活的AKI患者仍可進展為慢性腎臟病(CKD)[1-4]。多種CKD均以腎纖維化為共同終點且難以逆轉(zhuǎn)。腎纖維化以細胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積導(dǎo)致組織瘢痕為特征,其發(fā)生發(fā)展的機制尚不明確,目前臨床上無有效防治措施。

熱量限制(CR)預(yù)處理對腎損傷的保護作用在多種嚙齒類動物損傷模型中得以證實[5-7]。近期來自科隆大學的Roman-Ulrich Müller團隊在腎臟缺血再灌注損傷(IRI)模型,探討了CR對腎損傷保護作用的分子機制[8]。但是在臨床實踐中多面臨的是腎臟缺血的后期階段,而CR在腎臟缺血后修復(fù)中的作用及機制尚不清楚。本文擬探討CR對腎臟IRI后纖維化的影響及機制。

對象與方法

研究對象C57BL/6J小鼠購于三峽大學實驗動物中心。腎小管特異性ATG7基因敲除(RT-Atg7-KO)鼠是通過ATG7 flox/flox小鼠同KSP3.1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交培育建立的RT-Atg7-KO小鼠模型(圖1)。ATG7 flox/flox和KSP3.1-Cre小鼠購自美國緬因州Jackson實驗室。自噬報告小鼠為RFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)基因鼠[C57BL/6-Tg(CAG/RFP/EGFP/Map1LC3B)1Hill/J],購自美國緬因州Jackson實驗室。

圖1 A：腎小管特異性ATG7基因敲除鼠的鑒定及驗證;B：ATG7免疫印跡代表圖

實驗方法

分組和造模 本動物研究方案經(jīng)三峽大學倫理委員會批準(批準文號202205010T2)。將體重為20～25 g的C57BL/6J雄性小鼠(共20只)隨機分為假手術(shù)組、假手術(shù)CR組、IRI組(左側(cè)腎臟缺血30 min再灌注)、IRI-CR組(左側(cè)缺血30 min再灌注CR),每組5只鼠。按照文獻報道的方法,術(shù)前麻醉小鼠,分離左側(cè)腎動脈,用動脈夾夾閉左側(cè)腎動脈30 min,后松開動脈夾,將小鼠肌層和皮膚層依次縫合[9]。整個手術(shù)過程小鼠體溫維持在(36 ℃～37.2 ℃)。術(shù)后第3天開始,CR組小鼠限時喂食(進食時間3.5 h),每日飲食攝入量為正常水平的 66%,對照組小鼠缺血術(shù)后自由飲食,所有動物均自由飲水。每天限時飲食時觀察各組小鼠狀態(tài)情況并記錄。在再灌注第20天行右腎切除術(shù),右腎切除術(shù)后24 h麻醉小鼠并通過左側(cè)腎動脈取血,留取血清樣本采用7 600 p Hitachi生化儀器檢測血清肌酐、尿素氮。同時左側(cè)腎臟做冠狀切面,留取部分組織行病理檢查(圖2A)。RFP-GFP-LC3融合蛋白的自噬報告小鼠、RT-Atg7-KO鼠的造模方法與C57BL/6J雄性小鼠一致。

免疫組化和腎小管損傷評分 經(jīng)多聚甲醛固定后的腎組織分別經(jīng)過梯度乙醇70%、85%、95%、100%脫水以及二甲苯處理后進行石蠟包埋。5 μm的石蠟切片經(jīng)過二甲苯和乙醇的逐步水化后進行免疫組化、Masson及HE染色,染色腎組織石蠟切片脫蠟后水洗,檸檬酸抗原修復(fù),封閉。Beclin1一抗(proteintech,11306-1-AP,1∶200)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗(RnDSystems, MAB1420-SP,1∶20)。

腎小管損傷評分:視野內(nèi)有0～25%損傷小管為1分,視野內(nèi)有26%～50%損傷小管為2分,視野內(nèi)有51%～75%損傷小管為3分,視野內(nèi)有>75%損傷小管為4分。 所有的切片為隨機檢查外髓質(zhì)和皮質(zhì)部分,每張切片檢測10個視野,取平均值計算腎小管損傷評分,用顯微鏡拍攝具有代表性的照片。

免疫印跡 SDS蛋白裂解液提取各組腎皮質(zhì)組織蛋白,檢測ATG7(Proteintech,10088-2-AP,1∶1 000)、β-actin(ZEN BIO,380624,1∶5 000)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)(Novusbio,NB100-2220,1∶1 000)的表達。稀釋后的一抗4℃孵育過夜,洗滌后辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗孵育1 h。使用化學發(fā)光對印跡進行檢測。

統(tǒng)計學方法采用《Graph Pad Prism 9.0.0》進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)以平均±標準差表示。采用配對t檢驗確定兩組間的統(tǒng)計學意義。采用單因素方差分析確定兩組以上之間的統(tǒng)計學意義。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

CR加重了腎缺血性纖維化結(jié)果顯示,IRI后采用CR處理組血清肌酐(圖2B)和尿素氮(圖2C)較正常飲食組顯著升高。腎組織HE染色可見IRI后腎間質(zhì)炎性浸潤、小管擴張、間質(zhì)增生等損傷,其中CR處理組明顯加重(圖3A)、腎小管損傷評分CR組較高(圖3B)。最值得關(guān)注的是,相比于單純IRI組,CR組細胞外基質(zhì)的過度沉積導(dǎo)致組織瘢痕異常明顯,包括炎癥細胞浸潤、肌成纖維細胞活化、小管萎縮和毛細血管稀疏化等(圖4A)。纖維化標志物α-SMA的表達和纖維化面積比也在CR處理組明顯增加(圖4B、C)。

圖2 實驗流程及C57BL/6J小鼠腎功能Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;A:動物實驗流程圖;B:各組血清肌酐結(jié)果;C:各組尿素氮結(jié)果;*:與Sham 或者 Sham+CR組相比,P<0.05;#:與UI30R組相比,P<0.05;n=5

圖3 C57BL/6J小鼠腎臟組織HE染色及腎小管間質(zhì)損傷評分Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;A:腎組織HE染色(×400);B:腎小管損傷評分;*：與Sham組或者Sham+CR組相比,P<0.05;#與UI30R組相比,P<0.05;n=5

CR增強了腎缺血后自噬活性在表達RFP-GFP-LC3融合蛋白的自噬報告小鼠IRI模型中發(fā)現(xiàn),AKI后小鼠腎小管細胞黃綠色及紅熒光均增強,提示自噬活性增強。最值得關(guān)注的是,IRI后經(jīng)過CR處理組腎小管細胞紅色熒光尤為顯著增強,提示自噬溶酶體形成增加(圖5A、B)。在C57BL/6J小鼠IRI模型中發(fā)現(xiàn),腎臟的細胞自噬標記蛋白Beclin1水平上升。當經(jīng)過CR處理后Beclin1表達更為顯著(圖5C)。LC3B免疫印跡結(jié)果同熒光結(jié)果一致(圖5D、E)。這些結(jié)果均表明,CR顯著增強了腎缺血后腎小管上皮細胞自噬活性。

圖4 C57BL/6J小鼠腎臟組織病理及間質(zhì)纖維化面積比Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;α-SMA:α平滑肌肌動蛋白;A:腎組織Masson染色(×400);B:腎組織α-SMA組化染色(×400);C:間質(zhì)纖維化面積比;*:與Sham組或者Sham+CR組相比,P<0.05;#：與UI30R組相比,P<0.05;n=5

圖5 自噬報告小鼠腎臟組織RFP-GFP-LC3熒光、C57BL/6J小鼠Beclin1組化及LC3B免疫印跡代表圖LC3:微管相關(guān)蛋白輕鏈 3;Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;A:CR組激活自噬，自噬溶酶體形成(IF，×400);B:單位腎小管上皮細胞LC3點數(shù)半定量;C:Beclin1表達在CR組增高(IH，×400);D:LC3B免疫印跡;E:LC3Ⅱ/Ⅰ半定量分析；*：與Sham組相比,P<0.05;#：各組黃綠色點數(shù)相比,P<0.05;n=5>

CR對腎缺血性纖維化的影響在自噬被抑制后明顯減弱為了進一步探討自噬在CR促進小鼠的腎缺血性纖維化進程的作用,我們將腎小管特異性ATG7基因敲除鼠分組行單側(cè)IRI及CR處理實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎小管特異性ATG7敲除后,CR對小鼠的腎臟缺血性纖維化影響消失(圖6A～C)。同時,在腎小管特異性ATG7敲除鼠中,CR對肌酐及尿素氮的影響也消失(圖6D、E)?？梢?自噬被抑制以后CR對腎缺血性纖維化的影響消失。上述結(jié)果提示,IRI后CR處理可能由于過度激活自噬引起腎臟纖維化加重。CR影響缺血性腎臟纖維化的進展同自噬密切相關(guān)。

圖6 ATG7敲除鼠腎臟組織病理和腎功能Sham:假手術(shù)組;CR:熱量限制;UI30R:單側(cè)缺血30 min再灌注組;α-SMA:α平滑肌肌動蛋白;A:ATG7敲除后，CR對腎缺血性纖維化影響消失(Masson染色，×400);B:ATG7敲除后，CR組α-SMA表達與UI30R組無明顯差異(IH，×400);C:半定量分析;D:ATG7敲除后，CR組與UI30R組血清肌酐無明顯差異;E:ATG7敲除后，CR組與UI30R組血尿素氮無明顯差異;#:與UI30R組相比,P<0.05

討 論

在闡釋腎纖維化的機制和制訂相應(yīng)治療策略中,盡管許多研究者已作出了巨大努力,但在如何阻止腎纖維化進展方面仍無可行的有效方案。近年來,CR的研究較熱門,而CR對腎缺血后纖維化進程的影響目前尚無研究,本研究試圖探討了這一科學問題。我們發(fā)現(xiàn)在IRI后,CR干預(yù)對腎臟IRI損傷后修復(fù)并未呈現(xiàn)出保護作用,反而加重了腎纖維化。

AKI后腎臟纖維化的過程中,成纖維細胞活化伴隨著炎癥細胞的浸潤,如中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等。腎小管上皮細胞發(fā)生多種變化,包括部分上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化、細胞周期阻滯、細胞衰老和凋亡,導(dǎo)致腎小管萎縮。毛細血管內(nèi)皮細胞損傷,發(fā)生衰老和凋亡,導(dǎo)致微血管稀疏化[10]。所有這些細胞成分都可能通過分泌ECM成分、細胞外囊泡、可溶性因子和代謝產(chǎn)物來促進腎臟纖維化的形成[11]。貫穿這一轉(zhuǎn)變過程需要大量能量的支持,CR必然帶來各種重新分配。如CR可誘導(dǎo)細胞代謝途徑轉(zhuǎn)向糖酵解[12]。另外,既往有研究指出,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激酶為營養(yǎng)和能量感知的靶點[13]。mTOR通路又是自噬調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？梢奀R影響較大的生物學過程包括細胞自噬。自噬是對細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細胞器進行管理和質(zhì)量控制的生物現(xiàn)象,在機體的生理和病理過程中均可見。研究證實,當細胞受到應(yīng)激時,原本處于低水平維持平衡生物分子的恒定合成的自噬,就會被大幅度上調(diào),這種變化增加了細胞的吸收和降解功能,將大分子物質(zhì)釋放回胞質(zhì)中以驅(qū)動必需的代謝反應(yīng)并產(chǎn)生能量[14-16]。自噬是各種疾病的重要調(diào)節(jié)器,其作用是正面的還是負面的尚未完全闡明[17-19]。已證實,腎缺血性纖維化全過程中均存在自噬的變化,在缺血損傷的早期,大部分學者認為發(fā)揮保護作用,但是在AKI后修復(fù)不良性的腎臟纖維化進程中的作用尚不清楚,值得進一步探討。有學者發(fā)現(xiàn)自噬可能通過加重脂毒性從而促進了腎纖維化進展[20]。故本研究探討了細胞自噬在AKI向CKD轉(zhuǎn)變過程中的影響。研究發(fā)現(xiàn),CR和IRI均可激活自噬,當IRI組小鼠被CR處理3周后,自噬持續(xù)激活,且較單因素處理更強。我們在表達RFP-GFP-LC3融合蛋白的自噬報告小鼠進一步驗證發(fā)現(xiàn),CR處理IRI組小鼠后,小鼠近端小管的細胞自噬水平顯著增加,并且在手術(shù)后3周同樣能觀察到明顯的自噬小體和自溶小體的存在?？梢?在AKI向CKD轉(zhuǎn)化的過程中,自噬的過度激活對腎臟損傷后的修復(fù)極為不利。由此我們推測CR通過進一步激活自噬從而加重IRI后腎纖維化進展,AKI之后抑制自噬的活性可能有助于延緩腎纖維化。

自噬相關(guān)基因ATG7編碼泛素E樣連接酶,在ATG12與ATG5結(jié)合前激活A(yù)TG12,促進前吞噬體的擴張,ATG7還促進蛋白質(zhì)LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺的脂質(zhì)化,產(chǎn)生LC3Ⅱ。ATG7全敲除小鼠出生24 h內(nèi)死亡[21]。由此可見,ATG7是自噬現(xiàn)象中的關(guān)鍵基因,所以我們選擇ATG7條件敲除小鼠作為研究對象,探討自噬阻斷后CR對腎臟缺血損傷后的修復(fù)情況。干預(yù)細胞自噬對小鼠AKI-CKD進程中有什么影響呢?本研究通過條件性腎小管ATG7敲除小鼠進行IRI后,給予CR處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATG7敲除后,CR干預(yù)組腎臟纖維化程度與非CR組相當。有學者發(fā)現(xiàn),腎臟纖維化促進因子TGF-β1、PDGFB、CTGF和FGF2的表達在AKI之后均顯著上調(diào),在ATG7敲除小鼠中僅觀察到FGF2較低,這一研究提示自噬可能促進了FGF2的分泌[8]。在本研究中,ATG7敲除后消除了CR對IRI后腎臟慢性化進程的影響,進一步驗證了CR可通過進一步激活自噬加重AKI后的腎纖維化。既往學者證實AKI前CR處理具有腎臟保護作用,而我們在AKI后CR加重腎損傷。這一現(xiàn)象提示,CR激活自噬在AKI的不同階段將發(fā)揮不同的作用。然另有研究發(fā)現(xiàn),衰老使腎脂肪酸氧化途徑活性降低,促進腎纖維化表型。而CR可改善衰老過程中受損的腎脂肪酸氧化途徑,減緩了纖維化進程[22]。同時衰老也伴自噬功能障礙[23]?？梢奀R在誘發(fā)纖維化的背景及干預(yù)時間不同的情況下,對腎纖維化的影響截然相反。在臨床工作中,對預(yù)判可能發(fā)生AKI的患者適當?shù)腃R預(yù)處理可能有助于預(yù)防AKI的發(fā)生或減輕AKI的程度,而對于AKI后的患者保持充足的熱量供應(yīng)可能會促進腎損傷的修復(fù),阻止或延緩纖維化的進展。

總之,本研究為防治AKI后腎纖維化提供了新思路。在AKI后的修復(fù)過程中,細胞自噬可能影響腎纖維化促進因子的分泌。因此,在腎移植受者恢復(fù)期給予充足熱量供應(yīng)是非常重要的,同時我們可通過抑制自噬緩解AKI向CKD的轉(zhuǎn)變,這為腎移植受者的恢復(fù)期需要足夠的熱量提供了重要依據(jù)。