韋 偉 楊樂(lè)天 綜述 趙宇亮 審校

急性腎損傷(AKI)表現(xiàn)為可由多種因素導(dǎo)致的有效腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的快速降低,是住院患者常見(jiàn)的并發(fā)癥,顯著延長(zhǎng)患者住院時(shí)間、增加醫(yī)療花費(fèi),部分患者可進(jìn)展為慢性腎臟病甚至終末期腎病。重癥AKI患者常常合并多種臟器衰竭、死亡率高,是全球范圍內(nèi)一項(xiàng)重大的醫(yī)療挑戰(zhàn)。AKI的病理生理機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全闡明。腎小管上皮細(xì)胞(TEC)線(xiàn)粒體分布集中、代謝活躍,對(duì)傷害刺激敏感,是AKI主要的受累細(xì)胞。TEC破壞可加重炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,引起免疫和能量代謝紊亂,進(jìn)一步加重疾病過(guò)程。緊密連接是連接和錨定相鄰TEC的主要結(jié)構(gòu),對(duì)于維持腎小管屏障的完整性至關(guān)重要。在AKI中,緊密連接結(jié)構(gòu)破壞可能導(dǎo)致腎小管反漏,引起有效GFR的下降和容量復(fù)蘇抵抗型少尿,TEC的緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞是誘發(fā)AKI的關(guān)鍵因素。動(dòng)物研究表明AKI伴隨著緊密連接結(jié)構(gòu)破壞和緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)異常,而修復(fù)緊密連接的結(jié)構(gòu)則能有效降低AKI發(fā)病率。對(duì)緊密連接的深入理解將有助于深入闡釋AKI的發(fā)病機(jī)制,并尋找AKI潛在的新型治療靶點(diǎn)。本文主要從緊密連接的分布和結(jié)構(gòu)、緊密連接和AKI的關(guān)系,緊密連接在AKI診療中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

緊密連接的結(jié)構(gòu)和分布

緊密連接是一種亞細(xì)胞器,廣泛分布于各種組織或器官的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,在頂端膜和基底外側(cè)膜構(gòu)成細(xì)胞間黏膜的屏障,起“柵欄”和“屏障”作用。緊密連接能夠阻止溶質(zhì)向細(xì)胞間隙擴(kuò)散,調(diào)節(jié)離子、水和分子的轉(zhuǎn)運(yùn),維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。早在上世紀(jì)發(fā)現(xiàn),在多種動(dòng)物的不同器官的細(xì)胞之間,如腎臟、肝臟、脾臟、腮腺、腎上腺等,都存在緊密連接,起到擴(kuò)散屏障或“密封”的作用,是上皮屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

緊密連接主要由跨膜蛋白(claudin家族、occludin家族、tricellulin家族、JAM家族)和閉鎖小帶蛋白(ZO-1、ZO-2和ZO-3)組成完整的分子屏障(圖1)?？缒さ鞍淄ㄟ^(guò)羧基端與ZO蛋白家族(ZO-1)的支架蛋白相互作用,經(jīng)肌動(dòng)蛋白結(jié)合到細(xì)胞骨架上,ZO-1作為緊密連接和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的連接,共同定位于頂端上皮細(xì)胞之間的連接處,形成緊密連接結(jié)構(gòu)[2],共同調(diào)節(jié)細(xì)胞旁間隙的通透性,維持細(xì)胞的極性和器官的正常生理功能,如TEC的選擇滲透性。細(xì)胞旁的滲透性至少由直徑為～4?的電荷選擇小通道途徑和直徑至少為～60?的分子滲透的選擇途徑共同決定。

各類(lèi)組織或器官上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)相似,功能相近。如腸上皮細(xì)胞中,緊密連接結(jié)構(gòu)與腎小管細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)相似,由跨膜蛋白和支架蛋白構(gòu)成,其完整性對(duì)于維持細(xì)胞間水、離子和大分子的細(xì)胞旁通透性具有重要作用,屏障完整性的破壞會(huì)激活免疫細(xì)胞并導(dǎo)致腸道炎癥。Hwang等[3]評(píng)估緊密連接蛋白在小鼠中各臟器中的分布,發(fā)現(xiàn)occludin、ZO-1和JAMs在腎、腸、肝、肺和大腦均有表達(dá),表達(dá)水平無(wú)明顯差異,共同維持離子和溶質(zhì)的滲透性。在小鼠的上皮細(xì)胞緊密連接鏈中也有claudin和occludin的表達(dá)。針對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的研究證明claudin-2、occludin和ZO-1在人類(lèi)TEC表達(dá)豐富,使用siRNA下調(diào)緊密連接蛋白基因,TEC屏障功能受損和細(xì)胞旁通透性改變,證明緊密連接是維持TEC正常生理功能的必要結(jié)構(gòu)。而通過(guò)敲除犬腎細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)的tricellulin基因表達(dá),增加了離子的滲透性。顯而易見(jiàn),claudin、occludin、JAMs、tricellulin和ZO蛋白是構(gòu)成腎小管上皮細(xì)胞緊密連接主要結(jié)構(gòu),且分布在腎臟的不同節(jié)段(圖2)。

圖1 腎小管上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)示意圖bTJs:雙細(xì)胞緊密連接;tTJs:三細(xì)胞緊密連接

圖2 腎臟緊密連接蛋白的分布示意圖occludin:閉合蛋白;ZO-1:閉鎖小帶蛋白1;JAML:連接黏附分子樣蛋白;JAM4:連接黏附蛋白4

claudin蛋白claudins是一類(lèi)屬于跨膜蛋白家族的緊密連接蛋白,分子質(zhì)量在21～34 kD,包括4個(gè)疏水的跨膜區(qū)、2個(gè)細(xì)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)、1個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)和位于胞質(zhì)中的羧基末端、氨基末端,其中第一個(gè)細(xì)胞外環(huán)定位在細(xì)胞旁孔,決定了細(xì)胞旁通道的選擇性,第二個(gè)細(xì)胞外環(huán)則介導(dǎo)反式相互作用。claudin各亞型通過(guò)反式和順式相互作用形成緊密連接鏈,其羧基端則直接與ZO-1相互作用。

claudin蛋白作為緊密連接最重要的組成部分,決定細(xì)胞旁的轉(zhuǎn)運(yùn),緊密連接的緊密程度是離子和水的選擇性、滲透性的主要決定因素,其緊密程度主要取決于claudin的亞型及其組合方式。1998年,Furuse等[4]首次發(fā)現(xiàn)claudin-1和claudin-2,在上皮細(xì)胞緊密連接形成對(duì)離子和水具有選擇性和滲透性的細(xì)胞旁通路;在缺乏緊密連接的纖維細(xì)胞中,引入外源性claudin-1促進(jìn)了緊密連接的形成,特異性敲除MDCK細(xì)胞的claudin-4后,緊密連接的結(jié)構(gòu)的完整性和復(fù)雜性顯著降低,均表明claudin蛋白在緊密連接中起核心作用。

occludin蛋白o(hù)ccludin蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的緊密連接蛋白,其分子量約為65 kD,由四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)構(gòu)成,有一個(gè)較短的N端和一個(gè)較長(zhǎng)的C端,C端與ZO-1、ZO-2相連,對(duì)緊密連接結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定至關(guān)重要。緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞,伴隨著occludin表達(dá)的改變,引起上皮細(xì)胞屏障的受損,導(dǎo)致一系列疾病。朱茂英等[6]用慢病毒轉(zhuǎn)染抑制occludin蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)緊密連接結(jié)構(gòu)的緊密程度也跟隨下降。在MDCK細(xì)胞中occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)下降,導(dǎo)致了腎小管上皮細(xì)胞屏障的破壞。occludin蛋白的表達(dá)水平與內(nèi)皮屏障的特異性呈正相關(guān),但其具體機(jī)制有待闡明。

tricellulin蛋白tricellulin緊密連接屬于跨膜MAGUK家族,包括兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的N端、C端,通細(xì)胞連接處的肌動(dòng)球蛋白促進(jìn)緊密連接的形成,封閉了上皮細(xì)胞的三細(xì)胞間連接處的間隙,主要影響大分子物質(zhì)的通透性,在雙細(xì)胞緊密連接中主要降低離子的滲透性。它參與了細(xì)胞遷移和分裂的方向、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)特性,使上皮細(xì)胞更好的發(fā)揮屏障作用[7]。

tricellulin蛋白主要定位于緊密連接。Ikenouchi等[8]研究發(fā)現(xiàn)在不同的臟器中,tricellulin蛋白主要表達(dá)于上皮細(xì)胞的三細(xì)胞緊密連接處,當(dāng)tricellulin蛋白的表達(dá)受到抑制時(shí),上皮細(xì)胞的緊密連接的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,屏障功能受損。以上表明了tricellulin蛋白是組成上皮細(xì)胞屏障的一部分。

JAM蛋白JAM蛋白是一類(lèi)單跨膜蛋白,屬于免疫球蛋白超家族,可以選擇性的富集于各類(lèi)上皮細(xì)胞的緊密連接處,調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的極性。1998年,Sosnovtsev等[9]首次發(fā)現(xiàn)了JAM蛋白。JAM蛋白是由一個(gè)細(xì)胞外區(qū)域的兩條Ig樣結(jié)構(gòu)域的N端、一個(gè)單跨膜蛋白區(qū)和一個(gè)在胞質(zhì)尾部具有Ⅱ型PDZ 結(jié)構(gòu)域的C端組成,主要家族成員有JAM-A、JAM-B、JAM-C、JAM-4和JAM-L蛋白。其中JMA4與ZO-1共同存在于腎小球,與膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶蛋白MAGUK-1在緊密連接處相互作用,調(diào)節(jié)腎小球上皮細(xì)胞的通透性。JAM蛋白表達(dá)的改變與腎臟疾病的發(fā)生相關(guān)。在Fu等[10]研究首次發(fā)現(xiàn),在糖尿病腎病及其他伴蛋白尿的慢性腎臟病中,腎小球中的JAML表達(dá)顯著升高,在足細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

ZO蛋白ZO蛋白是緊密連接的支架蛋白,屬于MAGUK蛋白家族,ZO-1、ZO-2和ZO-3分子質(zhì)量分別為210～225 kD、160 kD和130 kD,由PDZ結(jié)構(gòu)域(PDZ1、PDZ2和PDZ3)、一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鳥(niǎo)苷酸激酶同源(GUK)的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。其富集于上皮細(xì)胞間的緊密連接,ZO蛋白的PDZ結(jié)構(gòu)域與跨膜蛋白緊密連接蛋白的羧基端結(jié)合,與肌動(dòng)蛋白結(jié)合固定于細(xì)胞骨架上,作為支撐細(xì)胞緊密連接蛋白的平臺(tái)[11],穩(wěn)定緊密連接,防止物質(zhì)的自由擴(kuò)散,維持自身的極性。在小鼠和犬的各類(lèi)器官的上皮細(xì)胞緊密連接均存在ZO-1、ZO-2;抑制上皮細(xì)胞ZO-1、ZO-2的表達(dá),雖然上皮細(xì)胞分化良好,但緊密連接完全缺乏。ZO的損傷或缺失,導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)的不完整,降低緊密連接的機(jī)械敏感性,破壞細(xì)胞旁的通透性。ZO-1在許多相關(guān)腎臟疾病的近端小管中表達(dá)均為上調(diào),進(jìn)一步證明了ZO是緊密連接的重要組成部分。

緊密連接與AKI

緊密連接損傷是啟動(dòng)AKI的關(guān)鍵因子,其損傷程度與AKI的嚴(yán)重程度密切相關(guān),影響AKI 的預(yù)后。許多研究發(fā)現(xiàn),不同類(lèi)型的AKI均伴隨緊密連接結(jié)構(gòu)及其相關(guān)蛋白表達(dá)的改變。

缺血再灌注急性腎損傷(IR-AKI)在IR-AKI模型中,緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞,TEC的緊密連接蛋白的表達(dá)水平改變,IR-AKI的發(fā)生與緊密連接蛋白密切相關(guān)。李志輝等[12]發(fā)現(xiàn),IR-AKI模型小鼠claudin-2、claudin-10、claudin-17 蛋白和mRNA的表達(dá)顯著下降。通過(guò)敲除claudin-2基因,小鼠IR-AKI的易感性增加。對(duì)AKI進(jìn)行干預(yù)后,claudin-2表達(dá)的上調(diào),細(xì)胞和腎功能的損傷減輕。claudin-17蛋白和mRNA的表達(dá)上調(diào),24 h后開(kāi)始下調(diào);對(duì)IR-AKI進(jìn)行缺血預(yù)處理后,上述蛋白的改變趨勢(shì)趨于平緩。claudin-7在腎臟缺血性損傷中表達(dá)的升高也被證實(shí)。在IR-AKI的研究中,Huang等[13]發(fā)現(xiàn)連接黏附分子樣蛋白(JAML)的表達(dá)上調(diào),抑制其表達(dá)則可減輕腎臟炎癥,減輕腎缺血再灌損傷;Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)occludin和ZO-1蛋白表達(dá)的下調(diào),TEC的緊密連接鏈斷裂;Xiong等[15]研究發(fā)現(xiàn)ZO-1、claudin-1和claudin-4表達(dá)的下調(diào);Meurer等[16]研究發(fā)現(xiàn),claudin(2、10、16、19)表達(dá)的下調(diào);Kieran等[17]研究顯示claudin(1、3、7)表達(dá)上調(diào);而Tet2的缺乏加重了IR-AKI,下調(diào)了clauidn-8和ZO-1的mRNA水平。在腎臟移植誘導(dǎo)的IR-AKI中,ZO-1的表達(dá)水平下調(diào)。在不同類(lèi)型的IR-AKI中均發(fā)現(xiàn)claudin-1和claudin-7表達(dá)的下調(diào)。

膿毒癥急性腎損傷(SAKI)在SAKI中,亦發(fā)現(xiàn)了TEC的緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞及其蛋白表達(dá)水平改變。脂多糖(LPS)誘導(dǎo)AKI的發(fā)生后,腎小管的通透性發(fā)生改變,緊密連接處發(fā)生滲透,細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生水腫。有相關(guān)研究顯示,在SAKI中伴隨TEC的凋亡和ZO-1表達(dá)的下調(diào)。在SAKI體、內(nèi)外模型研究發(fā)現(xiàn), ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達(dá)下調(diào),腎小管上皮細(xì)胞的緊密連接處的通透性發(fā)生改變,加重腎臟損傷;Cheng[18]等發(fā)現(xiàn),occludin蛋白的表達(dá)下調(diào),損傷腎臟;Zheng等[19]研究發(fā)現(xiàn)TEC中緊密連接的破壞及其JAM-3表達(dá)的下調(diào);Eadon等[20]發(fā)現(xiàn),ZO-1、claudin-4的蛋白表達(dá)下調(diào),而mRNA表達(dá)則上調(diào);claudin-1、claudin-3均表現(xiàn)為上調(diào);claudin-8只有mRNA表達(dá)水平下調(diào);證實(shí)了SAKI伴隨著TEC緊密連接蛋白的變化。

藥物相關(guān)AKI腎臟是清除體內(nèi)代謝物質(zhì)、廢物及藥物的重要器官,腎毒性藥物會(huì)損傷腎臟,引起AKI。在赭曲霉毒素A所致AKI中,腎細(xì)胞膜通透性增加,緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞,occludin和ZO-1蛋白表達(dá)下調(diào)。在順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)claudin-2、ZO-1的表達(dá)均下調(diào),而claudin-5 的表達(dá)未發(fā)生明顯改變;Lee等[21]在順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠模型發(fā)現(xiàn),ZO-1和occludin蛋白表達(dá)的下調(diào);Kim等[22]發(fā)現(xiàn),通過(guò)阻斷JAM-C的表達(dá),減輕了炎癥,在一定程度上恢復(fù)了腎功能。在順鉑、阿霉素和葉酸誘導(dǎo)的AKI中,均觀(guān)察到ZO-1的表達(dá)減少,且TEC的存活率下降。

其他類(lèi)型AKI馬希剛等[23]在急性肺損傷大鼠的腎損傷模型發(fā)現(xiàn)claudin-5、ZO-1蛋白表達(dá)的下調(diào),而通過(guò)上調(diào)claudin-5、ZO-1蛋白后,可減輕急性肺損傷大鼠的腎損傷。在重金屬誘導(dǎo)的AKI也伴隨緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞,影響腎臟功能。在AKI患兒腎組織中,伴有claudin-2的表達(dá)逐漸減少,且與腎損傷呈負(fù)相關(guān)。在小鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)誘導(dǎo)的AKI中亦有occludin蛋白表達(dá)下調(diào)。在IgA腎病及UUO-AKI發(fā)現(xiàn)claudin-1的表達(dá)上調(diào),且依賴(lài)于腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度。clauin-1的表達(dá)在造影劑所致的AKI中也表現(xiàn)為上調(diào)。在壞死性腸炎引起的AKI中伴有claudin(1～4、8)蛋白水平表達(dá)的上調(diào);在瘧疾相關(guān)性、燒傷膿毒性腦腎綜合征誘導(dǎo)的AKI發(fā)現(xiàn)ZO-1的表達(dá)減少和緊密連接的破壞。Xu等[24]在TNF-α誘導(dǎo)的AKI發(fā)現(xiàn)TEC的緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞,occludin和ZO-1表達(dá)的下調(diào)。在新生兒高壓氧所致的腎損傷伴隨claudin-4、occludin和ZO-1表達(dá)的下調(diào)。

AKI體外實(shí)驗(yàn)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,AKI傷害刺激后也觀(guān)察到細(xì)胞緊密連接出現(xiàn)類(lèi)似變化。如有學(xué)者使用過(guò)氧化氫一過(guò)性刺激MDCK Ⅱ細(xì)胞,借以模擬的IR-AKI中的氧化應(yīng)激反應(yīng),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)occludin、claudin-1和claudin-2在腎小管的定位發(fā)生改變、表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)[25]。在S-AKI的研究中,使用LPS刺激HK-2細(xì)胞,腎小管上皮細(xì)胞的通透性升高,JAM-3表達(dá)顯著下降[19]。在使用赭曲霉毒素A刺激后,MDCK細(xì)胞的緊密連接受到破壞,occludin和ZO-1的表達(dá)和定位發(fā)生明顯的改變。

AKI伴其他器官損傷AKI常波及遠(yuǎn)處全身器官緊密連接的破壞。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道AKI可引起腸上皮、肺上皮和血腦屏障等器官或組織的破壞。如在重癥AKI患者中,常常合并急性肺損傷,導(dǎo)致病死率增加,經(jīng)過(guò)CRRT治療后急性肺損傷得到改善[26]。在IR-AKI誘發(fā)的肺部炎癥反應(yīng),伴隨著肺上皮細(xì)胞的緊密連接的claudin-4、claudin-18和JAM-1表達(dá)下調(diào)。除了波及肺上皮細(xì)胞的緊密連接,IR-AKI還可引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞claudin-5和occludin的mRNA水平表達(dá)的上調(diào),損傷緊密連接。

AKI干預(yù)措施對(duì)緊密連接蛋白的影響

作用于緊密連接蛋白的藥物,可以調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá),減輕腎臟炎癥和損傷,改善腎功能。因此,緊密連接可作為AKI新的治療靶點(diǎn)。AKI干預(yù)措施對(duì)緊密連接蛋白影響的總結(jié)見(jiàn)表1。

表1 AKI干預(yù)措施對(duì)緊密連接蛋白的影響

在SAKI鼠模型中,使用右美托咪定和鹽酸戊乙奎醚進(jìn)行干預(yù),在一定程度上調(diào)了ZO-1和occludin蛋白的表達(dá)[27-28];二氫青蒿素的抗炎作用,維持了occludin蛋白的表達(dá)[18];全氟化碳促進(jìn)ZO-1表達(dá)上調(diào)[29];注射谷氨酰胺后,ZO-1的表達(dá)水平發(fā)生改變[30];消退素D1(AT-RvD1)預(yù)處理可恢復(fù)clauidn-4的表達(dá)[34]。

在順鉑誘導(dǎo)的AKI中,使用乳酸桿菌干預(yù)后,ZO-1和occludin表達(dá)上調(diào)[21]。脯氨酸羥化酶(FG-4592)的干預(yù)可恢復(fù)葉酸AKI導(dǎo)致的TEC結(jié)構(gòu)及功能的損傷[35]。在缺血再灌注/葉酸誘導(dǎo)的AKI中,EZH2和3-DZNeP預(yù)處理改善了ZO-1的下調(diào)[32]。在造影劑誘導(dǎo)的AKI中,使用福辛普利或替米沙坦治療,改善了claudin-1的下調(diào)[33]。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的腎損傷中,使用黃酮類(lèi)化合物治療,上調(diào)了occludin表達(dá)水平[31]。使用一氧化氮合酶抑制劑也可保護(hù)MDCK細(xì)胞免受輻射的損害,修復(fù)緊密連接結(jié)構(gòu)。

小結(jié):緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞是上皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志,緊密連接蛋白的定位和表達(dá)水平發(fā)生改變,導(dǎo)致TEC的屏障受損,嚴(yán)重影響腎臟的生理功能,加速AKI向慢性腎臟病、終末期腎病的進(jìn)展;而對(duì)緊密連接蛋白進(jìn)行干預(yù)后,AKI得到控制,提示緊密連接蛋白可作為AKI潛在的治療靶點(diǎn)。盡管目前有許多研究在分析緊密連接結(jié)構(gòu)、生理功能和病理取得重大進(jìn)展,證實(shí)緊密連接結(jié)構(gòu)與AKI的發(fā)生密切相關(guān),但緊密連接潛在發(fā)病機(jī)制尚不清楚。今后有待更多針對(duì)不同類(lèi)型AKI研究進(jìn)一步揭示緊密連接與AKI的關(guān)系,驗(yàn)證緊密連接蛋白作為AKI早期發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)的應(yīng)用前景。