劉楊，許淑娟，李瓊毅，劉翊忠

1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730030；

2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030

小窩結(jié)構(gòu)（Caveolae）是位于細(xì)胞表面的穴樣內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，可介導(dǎo)多種生物大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其中小窩蛋白-1（Caveolin-1）是Caveolae最重要的組成蛋白，也是Caveolae發(fā)揮作用最重要的蛋白。Caveolin-1相對(duì)分子質(zhì)量為21 000～24 000，廣泛分布于上皮、內(nèi)皮、成纖維及平滑肌細(xì)胞中，主要序列包括中央高度保守的疏水區(qū)及兩側(cè)可變的N-端和C-端區(qū)域［1］。

Caveolin-1是內(nèi)吞途徑的重要蛋白，在病毒感染宿主細(xì)胞早期發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。另外，該蛋白還可參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)排出及血管生成等［2-5］，Caveolin-1的腳手架結(jié)構(gòu)域（Caveolin scaffolding domain，CSD）與一些細(xì)胞膜上的信號(hào)分子也存在相互作用，調(diào)控細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化和癌變等過(guò)程［6］。近年來(lái)，隨著病毒感染宿主細(xì)胞研究機(jī)制的不斷深入，多項(xiàng)研究提示，Caveolin-1與病毒感染細(xì)胞密切相關(guān)；其可促進(jìn)大部分病毒如猿猴空泡病毒40、人冠狀病毒及口蹄疫病毒等感染宿主細(xì)胞［7-10］；同時(shí)對(duì)少量病毒如人類(lèi)免疫缺陷病毒的感染過(guò)程又發(fā)揮抑制作用［11-12］。

本實(shí)驗(yàn)從BHK-21細(xì)胞中擴(kuò)增Caveolin-1基因，經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化等過(guò)程構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRIPCav1；將其及對(duì)照質(zhì)粒pTRIP-EGFP分別轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，收集慢病毒并感染BHK-21細(xì)胞，構(gòu)建Caveolin-1過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株BHK-Cav1及過(guò)表達(dá)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protei，EGFP）的對(duì)照細(xì)胞株BHK-EGFP，并對(duì)兩種細(xì)胞株的穩(wěn)定性、過(guò)表達(dá)特性和細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及質(zhì)粒 倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21及人胚胎腎細(xì)胞HEK-293T均由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供；E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、載體pTRIPCMV及質(zhì)粒pTRIP-EGFP均由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；載體pMD18-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2主要試劑及儀器 TRIzol?Reagent試劑盒及LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Proliferation細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gromega公司；質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TIANScript M-MLV及TaqDNA聚合酶均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；BamHⅠ、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司；聚凝胺（Polybrene）、嘌呤霉素（Puromycin）及兔抗Caveolin-1單克隆抗體均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗GAPDH抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；新生牛血清（NBS）、胎牛血清（FBS）及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；PCR儀購(gòu)自德國(guó)Biometra公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；生物熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympns公司。

1.3Caveolin-1基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中登錄的Caveolin-1基因序列（NM_GU075958.1）應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-GCTCTAGAATGTCTGGGGGCAAATACGTGGACTC-3′，下游引物：5′-CGGGATCCTCATATCTCTTTCTGCGTGCTGATGC-3′，擴(kuò)增片段大小為537 bp。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-21細(xì)胞，按TRIzol?Reagent試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增Caveolin-1基因。反應(yīng)體系為：LA Taq 0.5μL，dNTP 8.0μL，10×PCR BufferⅡ5.0μL，cDNA 5.0μL，Caveolin-1-F 1.0μL，Caveolin-1-R 1.0μL，DEPC H2O 29.5μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，65.6℃45 s，72℃1 min；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用膠回收試劑盒說(shuō)回收目的條帶。

1.4pMD18T-Cav1克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T于22℃用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，構(gòu)建克隆質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含0.005 mg／mL Amp的瓊脂平板上，于37℃孵育箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單個(gè)菌落，接種于含0.005 mg／mL Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取克隆質(zhì)粒，將其命名為pMD18T-Cav1。

1.5pTRIP-Cav1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將pMD-18TCav1及pTRIP-CMV載體于37℃水浴中分別用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切2 h，回收的目的片段與載體片段于16℃用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒。按1.4項(xiàng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化及提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pTRIP-Cav1。

1.6B H K-C a v1及B H K-EG F P細(xì)胞株的構(gòu)建

1.6.1攜帶Caveolin-1及EGFP目的基因慢病毒的包裝構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293T細(xì)胞，接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，按LipofectamineTM2000 Reagent說(shuō)明書(shū)分別將0.75μg的pTRIP-Cav1及對(duì)照質(zhì)粒pTRIP-EGFP轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 h，更換為含10%NBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集含慢病毒的上清。

1.6.2慢病毒感染及BHK-Cav1和BHK-EGFP細(xì)胞株篩選 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-21細(xì)胞接種至96孔板中37℃培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，棄去含10%NBS的DMEM培養(yǎng)基，分別加入1.6.1項(xiàng)構(gòu)建的慢病毒混合液［500μL慢病毒上清+500μL DMEM（含20%FBS）+8μL Polybrene］［13］，混均后加入96孔板中，200μL／孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)12 h；更換為含10%FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，用10μg／mL Puromycin對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞篩選14 d，期間不斷去除未轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的死細(xì)胞，余下的活細(xì)胞即為轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的細(xì)胞。最終獲得過(guò)表達(dá)Caveolin-1細(xì)胞株BHK-Cav1及過(guò)表達(dá)EGFP的細(xì)胞株BHK-EGFP。均培養(yǎng)7代。

1.7B H K-C a v1和B H K-EG F P細(xì)胞株穩(wěn)定性驗(yàn)證

1.7.1BHK-EGFP細(xì)胞中EGFP表達(dá)的檢測(cè) 取培養(yǎng)過(guò)程中第10（P10）、20（P20）及30代（P30）BHK-EGFP細(xì)胞，以BHK-21細(xì)胞為對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)。

1.7.2BHK-Cav1細(xì)胞中Caveolin-1蛋白表達(dá)及基因mRNA水平的檢測(cè)

1.7.2.1Western blot 取培養(yǎng)過(guò)程中P10、P20及P30 BHK-Cav1細(xì)胞，以BHK-21細(xì)胞為對(duì)照。細(xì)胞用RIPA裂解，產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用0.25 g／L脫脂奶粉于室溫封閉1 h；加入兔抗Caveolin-1抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)?，室溫孵? h；PBST洗滌5次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫孵? h；PBST洗滌5次，ECL顯色。

1.7.2.2qRT-PCRCaveolin-1基因上游引物：5′-AACCAGAAGGGACACACAG-3′，下游引物：5′-AAGGAGAGAATGGCAAAGT-3′，產(chǎn)物大小為151 bp。按1.7.2.1項(xiàng)收集各生長(zhǎng)代次的BHK-Cav1細(xì)胞，以BHK-21細(xì)胞為對(duì)照。提取各組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃20 s，共40個(gè)循環(huán)。記錄CT值。

1.8B H K-C a v1、B H K-EG F P及B H K-21細(xì)胞中Caveolin-1過(guò)表達(dá)的檢測(cè)

1.8.1Westernblot及qRT-PCR法 檢測(cè)BHK-EGFP及BHK-Cav1細(xì)胞中Caveolin-1蛋白表達(dá)及基因mRNA水平，方法同1.7.2項(xiàng)。

1.8.2免疫熒光法 將P10 BHK-Cav1及P10 BHK-21細(xì)胞分別接種至24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%時(shí)，PBS洗滌3次，棄去PBS，加入70%乙醇，4℃過(guò)夜；次日吸去乙醇，PBS洗滌3次，加入兔抗Caveolin-1抗體（1∶200稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h；100 r／min搖床上PBS洗滌4次，每次5 min，加入熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶200稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h；PBS洗滌4次，加入細(xì)胞核染料DAPI，室溫孵育5 min；蒸餾水洗滌10 min，熒光封固劑固定，靜置10 min后觀察熒光。

1.9B H K-C a v1及B H K-EG F P細(xì)胞活力的檢測(cè) 分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BHK-21、BHK-EGFP和BHK-Cav1細(xì)胞接種至96孔板中傳代培養(yǎng)至P10代，待細(xì)胞貼壁后的0、24及48 h時(shí)，用Proliferation細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次。以BHK-21的細(xì)胞活力記為100%，比較3組細(xì)胞的相對(duì)活力變化。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Caveolin-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 目的基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)537 bp的特異性條帶，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。

圖1 Caveolin-1基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of Caveolin-1 gene

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒pTRIPCav1的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)537 bp的目的基因片段，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)?；蛐蛄姓_。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pTRIP-Cav1的雙酶切（XbaⅠ／BamHⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pTRIP-Cav1（XbaⅠ／BamHⅠ）

2.3 B H K-C a v1及B H K-EG F P細(xì)胞株的穩(wěn)定性

2.3.1BHK-EGFP細(xì)胞中EGFP的表達(dá) 與BHK-21細(xì)胞比較，P10、P20及P30 BHK-EGFP細(xì)胞熒光明顯，見(jiàn)圖3。表明EGFP可穩(wěn)定表達(dá)，BHK-EGFP細(xì)胞株構(gòu)建成功。2.3.2BHK-Cav1細(xì)胞中Caveolin-1蛋白表達(dá)及mRNA水平 與BHK-21細(xì)胞比較，P10、P20及P30 BHK-Cav1細(xì)胞中Caveolin-1蛋白表達(dá)水平增加；基因RNA水平顯著增加（t分別為5.103、7.545和5.243，P均＜0.01）。同時(shí)Caveolin-1蛋白表達(dá)及基因RNA水平不隨細(xì)胞代次的增長(zhǎng)而改變，具有較好的穩(wěn)定性。見(jiàn)圖4和圖5。

圖3 各組細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察（×20）Fig.3 Fluorescence microscopy of cells in various groups（×20）

圖4 各組細(xì)胞中Caveolin-1蛋白表達(dá)的Western blot分析Fig.4 Western blotting of Caveolin-1 protein expressed in various groups

圖5 各組細(xì)胞中Caveolin-1基因mRNA相對(duì)水平Fig.5 Relative mRNA levels of Caveolin-1 in various groups

2.4C a v eolin-1過(guò)表達(dá)B H K-C a v1及B H K-EG F P細(xì)胞中C a v eolin-1檢測(cè)結(jié)果 與BHK-EGFP和BHK-21細(xì)胞比較，BHK-Cav1細(xì)胞中Caveolin-1蛋白表達(dá)水平增加；基因mRNA水平顯著升高（t=6.081，P<0.01）。見(jiàn)圖6和圖7。

圖6 各組細(xì)胞中Caveolin-1蛋白表達(dá)的Western blot分析Fig.6 Western blotting of Caveolin-1 protein expressed in cells of various groups

2.5C a v eolin-1過(guò)表達(dá)B H K-C a v1細(xì)胞中C a v eolin-1熒光觀察 結(jié)果顯示，與BHK-21細(xì)胞比較，BHKCav1細(xì)胞中Caveolin-1散發(fā)的紅光明顯增強(qiáng)，見(jiàn)圖8。表明BHK-Cav1細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖8 免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞中Caveolin-1的表達(dá)（×40）Fig.8 IFA of expression of Caveolin-1 in cells of various groups（×40）

注：aa表示P<0.01。

2.6B H K-EG F P及B H K-C a v1細(xì)胞的活力 結(jié)果顯示，與同時(shí)間培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞比較，BHK-EGFP及BHK-Cav1細(xì)胞在0、24及48 h的細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為32.33、33.94和41.00，P均＞0.05），見(jiàn)圖9。表明構(gòu)建的BHK-Cav1和BHKEGFP細(xì)胞的活力與BHK-21細(xì)胞無(wú)顯著性差異。

圖9 不同時(shí)間各組細(xì)胞的活力Fig.9 Determination of cell vitalities in various groups at different time

3 討論

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Caveolin-1在一些人源細(xì)胞中表達(dá)量較低，但在數(shù)種鼠源細(xì)胞中均可穩(wěn)定表達(dá)，且在不同代次的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21中均可穩(wěn)定表達(dá)［6-7］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇從BHK-21細(xì)胞中擴(kuò)增Caveolin-1基因?yàn)槟康钠危瑯?gòu)建pTRIP-Cav1重組表達(dá)質(zhì)粒及BHK-Cav1細(xì)胞株。

本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)中篩選了慢病毒上清與含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基的不同配比，選取BHK-21細(xì)胞不病變的最大慢病毒上清含量，即按1∶1體積比配置慢病毒上清與含20%FBS的DMEM的轉(zhuǎn)導(dǎo)混合液，對(duì)BHK-21細(xì)胞進(jìn)行感染。本文以BHK-21細(xì)胞為對(duì)照，對(duì)BHK-Cav1及BHK-EGFP細(xì)胞株中蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性，Caveolin-1過(guò)表達(dá)及細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示，BHK-Cav1細(xì)胞可穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Caveolin-1，BHK-EGFP可穩(wěn)定過(guò)表達(dá)EGFP，且兩種細(xì)胞活力良好，證明穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pTRIP-Cav1重組表達(dá)質(zhì)粒和BHK-Cav1穩(wěn)定細(xì)胞株，同時(shí)驗(yàn)證了細(xì)胞株具有可穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的特性，并保證了細(xì)胞株的活力；使穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Caveolin-1的BHK-Cav1細(xì)胞和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)無(wú)關(guān)蛋白EGFP的BHK-EGFP細(xì)胞更有應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)為下一步研究病毒通過(guò)Caveolin依賴型內(nèi)吞途徑感染BHK-21細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。