黃翟，趙王麗，宋天揚，羅正輝，楊東瓊，葛繞玲，雷銀瓶，范金，易力，3

1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所，云南昆明650000；

2.昆明市疾病預防控制中心，云南 昆明650228；

3.國家藥品監(jiān)督管理局疫苗及生物制品質(zhì)量控制與評價重點實驗室，四川成都611731

Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗是2015年由國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準上市的國家一類創(chuàng)新疫苗［1］，該疫苗主要用于兒童預防脊髓灰質(zhì)炎病毒感［2-5］。在Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗生產(chǎn)過程中，病毒經(jīng)接種、培養(yǎng)、收獲后獲得病毒收獲液，經(jīng)過濾澄清超濾濃縮至一定倍數(shù)后，再經(jīng)凝膠過濾層析和離子交換層析純化獲得病毒純化液［6-7］。病毒純化液純度是質(zhì)量控制的重要指標之一，通過使用高效液相色譜儀搭配凝膠色譜柱進行純度檢定，根據(jù)峰高、峰面積、保留時間數(shù)據(jù)并結(jié)合峰型情況進行結(jié)果判定。

在對病毒純化液進行純度檢定的過程中，凝膠色譜柱多次上樣后會出現(xiàn)色譜柱填料塌陷、色譜柱堵塞等問題，造成色譜柱分離性能下降，出現(xiàn)肩縫、前沿峰、峰拖尾、峰低等異常峰型；另外樣品異常或色譜系統(tǒng)漏液、柱壓波動、檢測器異常（污染、燈能量降低等）等，也會導致峰型異常、峰低、保留時間漂移等［8-14］。當檢測結(jié)果出現(xiàn)異常時，使用對照品上樣，通過對結(jié)果分析，可快速確定異常是由樣品還是色譜柱引起。但由于Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液中的病毒由相對分子質(zhì)量為25 000~38 000的C抗原和D抗原組成［15-16］，市面上沒有相同規(guī)格的商售對照品，當檢測結(jié)果出現(xiàn)異常時，僅能通過更換色譜柱、檢查色譜系統(tǒng)無異常后重新上樣等操作才能找到原因，對檢定的及時性造成一定影響。

本研究對Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液進行超濾濃縮，得到對照品，并在不同溫度下進行保存，定期檢測純度，通過對峰高、峰面積、峰型、保留時間的分析，確定合適的保存溫度和時間，為Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液純度對照品的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病毒 Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒（Ⅲ型）純化液由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供。

1.2主要試劑及儀器 磷酸氫二鉀（AR）、磷酸二氫鉀（AR）、氯化鈉（AR）購自西隴科學股份有限公司；色譜柱［Waters ultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm）工作柱、Waters ultrahydrogel（6 mm×40 mm）保護柱］、高效液相色譜儀（1525-PDA2998）購自美國Waters公司。

1.3病毒純化液濃縮 取Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液于超濾離心管中，1 509×g離心10 min，收集離心管濾芯上剩余溶液混勻，最終濃縮倍數(shù)為10倍，取1 mL進行純度檢測。剩余樣品分裝至24個液相瓶中，1 mL／瓶。各取12瓶分別置4、-20℃條件下保存。分別對4、-20℃條件下保存0、3、6、9、12個月樣品進行純度檢測。

1.4純度檢測 流動相為0.1 mol／mL磷酸鹽-0.1 mol／mL氯化鈉緩沖液；流速為0.3 mL／min；檢測器為二極管陣列檢測器（PDA）；檢測波長為280 nm；色譜柱為Watersultrahydrogel 250（7.8 mm×300 mm）工作柱和Watersultrahydrogel（6 mm×40 mm）保護柱；柱溫為室溫；上樣量為100μL；采集時間為40 min。工作站軟件積分參數(shù)為默認，不調(diào)整積分參數(shù)，分別記錄各樣品峰高、峰面積、保留時間。

2 結(jié)果

2.1峰高變化4℃條件下保存12個月內(nèi)（含12個月），目標峰均能被檢出，峰高未見明顯下降，在0.071~0.081 7 Au之間；保存12個月后峰高（0.072 4 Au）較0個月（0.081 7 Au）降低了11.4%，降幅較小。在-20℃條件下保存12個月內(nèi)（含12個月），峰高隨保存時間延長而降低，保存12個月后峰高降低了44.3%（從0.081 7 Au下降至0.045 5 Au），降幅較大，但目標峰仍能被檢出。見圖1。

圖1 4和-20℃條件下保存12個月對照品中目標峰的峰高變化Fig.1 Change of height of target peak of reference substance during storage at 4 and-20℃for 12 months

由以上數(shù)據(jù)可以看出，對照品在4和-20℃保存12個月，目標峰均能被檢出。表明Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液進行超濾濃縮后獲得的對照品，在4和-20℃條件下放置12個月均能保持穩(wěn)定，4℃時峰高波動較-20℃時小。

2.2峰面積變化 4、-20℃保存條件下，對照品中目標峰峰型基本保持一致，-20℃目標峰前的基線抬起較4℃明顯，但不影響對目標峰結(jié)果的判定，峰面積百分比均為100%。見圖2。

圖2 4和-20℃條件下分別保存3、6、9、12個月對照品色譜圖Fig.2 Chromatograms of reference substance stored at 4 and-20℃for 3，6，9 and 12 months

4℃條件下保存12個月內(nèi)（含12個月），目標峰均能被檢出，峰面積隨保存時間延長整體呈降低趨勢，最低峰面積為保存12個月后（3 506 553 Au*s），較0個月（3 842 627 Au*s）僅降低8.8%，降幅較小。在-20℃條件下保存12個月內(nèi)（含12個月），峰面積隨保存時間的延長整體呈降低趨勢，最低峰面積為保存12個月后（2 468 449 Au*s），較0個月（3 842 627 Au*s）降低35.8%，降幅較大，但目標峰仍能被檢出。見圖3。

圖3 4和-20℃條件下保存12個月對照品中目標峰峰面積變化Fig.3 Change of area of target peak of reference substance during storage at 4 and-20℃for 12 months

由以上數(shù)據(jù)可以看出，對照品在4和-20℃保存12個月，目標峰均能被檢出，各樣品中目標峰峰型基本保持一致，峰面積百分比均為100%。表明Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液進行超濾濃縮后獲得的對照品，在4和-20℃條件下保存

12個月均能保持穩(wěn)定，4℃時峰面積波動較-20℃時小。

2.3保留時間變化 對照品中目標峰均能被檢出，目標峰保留時間在20.714~21.06 min之間，RSD為0.69%，見圖4。表明Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液進行超濾濃縮后獲得的對照品，在4和-20℃條件下保存12個月均能保持穩(wěn)定，目標峰保留時間具有良好的重復性。

圖4 4和-20℃條件下保存12個月對照品中目標峰的保留時間變化Fig.4 Change of retention timeof target peak of reference substance during storage at 4 and-20℃for 12 months

3 討論

本研究將Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液進行超濾濃縮后得到的對照品保存于4和-20℃條件下，并定期使用高效液相色譜法檢測純度。結(jié)果顯示，在4和-20℃條件下保存12個月內(nèi)，目標峰均能被檢出（峰面積百分比均為100%），保留時間具有良好的重復性，-20℃時的峰高和峰面積呈下降趨勢，4℃時的峰高和峰面積變化較小，且4℃時的峰高、峰面積波動小于-20℃時的峰高、峰面積波動，4℃時的峰型優(yōu)于-20℃時的峰型。Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液純度對照品在4和-20℃條件保存12個月內(nèi)均保持穩(wěn)定可正常使用。綜合結(jié)果分析和考慮實驗中操作的便利性，選擇4℃作為純度對照品的保存條件。

Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液純度對照品的建立，為使用高效液相色譜法進行純度檢定過程中出現(xiàn)異常結(jié)果時提供了可用的對照品，使用該對照品上樣，可快速確認異常結(jié)果是由樣品還是色譜柱異常造成的。Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗作為國家一類疫苗，用于兒童脊髓灰質(zhì)炎病毒的預防，其質(zhì)量關(guān)乎每個兒童的健康。病毒純化液的純度檢定是其重要的質(zhì)量控制指標之一，純度對照品的建立解決了商售對照品的缺乏對純度檢定異常結(jié)果分析帶來的困難，對于保障Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的質(zhì)量具有重要意義。

本研究尚存在不足之處，首先，本研究為前期探索試驗，未對蛋白含量進行檢測；其次，參考大部分對照品及標準品有效期為1年的要求，目前僅完成1年的檢測，期間純度峰的峰高、峰面積、保留時間雖然有一定變化，但在不同保存條件下保存1年后，純度峰均能自動積分，峰高（最低為0.045 5 Au）較高，峰面積（最低為2 468 449 Au*s）較大，保留時間波動（RSD為0.69%）較小，因此未能給出峰高、峰面積和保留時間的可接受標準。未來的工作中，我們將會關(guān)注Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液濃縮前后及不同保存條件下蛋白含量的變化，并持續(xù)觀察Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗病毒純化液純度對照品純度峰的峰高、峰面積、保留時間的變化，直至不能檢測到純度峰為止，從而確定峰高、峰面積、保留時間的可接受標準，同時也對對照品的保存時長進行持續(xù)研究。