張震，魏媛，王雪薇，郭紫嬋，趙蓉，王秀麗，王曉霞

山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西晉中030600

食管癌（esophageal cancer）分為食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma）［1］，其中90%為食管鱗癌，因其高發(fā)病率和高致死率，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。目前，用于早期篩查的特異性生物標(biāo)記物、臨床治療的特異靶點(diǎn)以及評價(jià)預(yù)后的相關(guān)生物標(biāo)記物均有待進(jìn)一步研究和發(fā)掘。

基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）是包含了高通量微陣列、下一代測序及其他形式的高通量功能基因組數(shù)據(jù)集的國際公共數(shù)據(jù)庫，同時(shí)，GEO還提供了幾種基于Web的工具和策略來進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和可視化［2］。在GEO數(shù)據(jù)庫中，關(guān)于食管鱗癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)已被收錄。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選食管鱗癌的差異表達(dá)基因，并進(jìn)一步構(gòu)建異常表達(dá)基因的互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心基因，利用該癌癥相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)庫分析核心基因的表達(dá)差異，為食管鱗癌的臨床靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載及處理 從GEO（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）中篩選出食管鱗癌相關(guān)的3個(gè)基因表達(dá)譜芯片GSE45168、GSE38129和GSE70409，篩選標(biāo)準(zhǔn)為樣本數(shù)≥10個(gè)，樣本分類明確，僅包含食管鱗癌組織和正常癌旁組織。GSE45168芯片包含5份例食管鱗癌組織和5份正常癌旁組織；GSE38129芯片包含30份食管鱗癌組織和30份正常癌旁組織；GSE70409芯片包含17份食管鱗癌組織和17份正常癌旁組織；利用平臺信息文件將表達(dá)譜芯片中的探針矩陣轉(zhuǎn)換為基因矩陣。

1.2差異表達(dá)基因的篩選 應(yīng)用GEO的在線分析軟件GEO2R對3個(gè)基因表達(dá)譜芯片分別進(jìn)行差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）對數(shù)的絕對值|log（FC）|≥1.5，分別得到3組差異表達(dá)基因，運(yùn)用火山圖將差異表達(dá)基因可視化。利用Draw Venn Diagram在線軟件取三者差異表達(dá)基因的交集，并作韋恩圖。

1.3基因本體（Gene Ontology，GO）功能注釋及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 通過在線網(wǎng)絡(luò)工具DAVID（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）6.8（https：／／david.ncifcrf.gov／）對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析［3］，并對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.4蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用在線分析軟件STRING 11.0（https：／／string-db.org／）分析差異表達(dá)基因的蛋白互作［4］，設(shè)置置信度閾值為大于0.4，將差異表達(dá)基因?qū)氩⑦\(yùn)行，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。利用生物信息學(xué)平臺Cytoscape對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理［5］。利用MCODE插件對PPI進(jìn)行進(jìn)一步分析，篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中連接最緊密的部分作為樞紐基因（hub gene）［6］。

1.5核心基因的差異表達(dá)分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對hub基因進(jìn)行差異表達(dá)分析［7］，在GEPIA數(shù)據(jù)庫中選擇箱式圖分析，輸入hub基因，選擇對應(yīng)的癌癥，設(shè)置P＜0.01，|log2（FC）|≥1。選擇TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的正常癌旁組織數(shù)據(jù)作為對照組，點(diǎn)擊繪制。通過對比觀察判斷hub基因的差異表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌和癌旁正常組織的差異表達(dá)基因 在P＜0.05，|log（FC）|≥1.5的篩選條件下，得到DEGs共2 529個(gè)，上調(diào)1 164個(gè)，下調(diào)1 365個(gè)，其中來自GSE45168的上調(diào)基因929個(gè)、下調(diào)基因1 091個(gè)（圖1A）；來自GSE38129的上調(diào)基因179個(gè)、下調(diào)基因206個(gè)（圖1B）；來自GSE70409的上調(diào)基因371個(gè)、下調(diào)基因581個(gè)（圖1C）。3個(gè)基因表達(dá)譜芯片取交集后的DEGs為191個(gè)，其中上調(diào)基因68個(gè)，下調(diào)基因123個(gè)，見圖2。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcanic map of DEGs

圖2 韋恩圖Fig.2 Venn diagram

2.2差異表達(dá)基因的GO功能注釋及KEGG通路富集分析 GO功能注釋結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)基因主要參與的生物學(xué)過程包括膠原蛋白的分解代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)的組成與分解和膠原纖維組織；參與的細(xì)胞組成為外泌體、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外區(qū)域蛋白；參與的分子功能為細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的組成、金屬內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性。見圖3。KEGG通路富集分析顯示，這些差異表達(dá)基因主要參與的通路為細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏著斑、PI3K-AKT信號通路等，見圖4。

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋Fig.3 GO functional annotation of DEGs

圖4 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析Fig.4 KEGGpathway enrichment analysis of DEGs

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選 利用STRING 11.0對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析得到的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖5。進(jìn)一步用MECOE篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中30個(gè)hub基因，見圖6。

圖5 由191個(gè)差異表達(dá)基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.5 PPI network constructed by 191 DEGs

圖6 MCODE篩選的PPI網(wǎng)絡(luò)中連接最緊密的兩個(gè)模塊Fig.6 Two most closely connected modules in the PPI network filtered by MCODE

2.4核心基因在食管鱗癌和癌旁正常組織中的差異表達(dá)分析 與TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的正常癌旁組織相比，30個(gè)hub基因均有顯著的差異表達(dá)（上調(diào)，下調(diào)）。其中VCAN、ASPM及KIF20A基因在食管鱗癌中未見相關(guān)報(bào)道，且與癌旁正常組織相比，VCAN、ASPM及KIF20A基因在食管鱗癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。見圖7。

圖7 3個(gè)hub基因的差異表達(dá)分析Fig.7 Differential expression analysis of three hub genes

3 討論

目前，基因芯片技術(shù)越來越多地應(yīng)用于惡性腫瘤差異基因的篩選，也使得GEO日趨完善，為腫瘤治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)記物的篩選提供了更多的可能。本研究以取自GEO的3個(gè)食管鱗癌基因表達(dá)芯片GSE45168、GSE38129和GSE70409為材料，篩選得到在3個(gè)基因芯片中癌和癌旁組織均具有顯著表達(dá)差異的191個(gè)DEGs，包含68個(gè)上調(diào)基因，123個(gè)下調(diào)基因。

GO分析是一種用于解釋基因和基因產(chǎn)物、高通量基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)特征及生物學(xué)屬性的方法，包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。GO功能注釋分析顯示，差異基因的功能主要集中在細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白、膠原纖維組織、外泌體、金屬內(nèi)肽酶、絲氨酸型內(nèi)肽酶。KEGG是一個(gè)處理基因組、生物途徑、疾病、藥物和化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫的集合。KEGG通路富集分析顯示，差異基因參與的主要通路為細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏著斑、PI3K-AKT信號通路等。這些結(jié)果提示，差異基因與食管鱗癌細(xì)胞侵襲遷移以及有絲分裂有關(guān)。為進(jìn)一步明確這些差異基因之間相互作用的關(guān)系，利用Cytoscape軟件的MCODE插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中連接最緊密的30個(gè)hub基因。差異表達(dá)分析顯示，這30個(gè)hub基因在食管鱗癌和癌旁正常組織中均具有顯著的表達(dá)差異。其中，VCAN、ASPM及KIF20A基因在食管鱗癌中未見相關(guān)報(bào)道。與癌旁正常組織相比，VCAN、ASPM及KIF20A基因在食管鱗癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。

VCAN屬于大型聚集硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）蛋白聚糖家族成員，由N-端G1域、C-端G3域以及G1和G3之間的CS鏈結(jié)合區(qū)域組成，是重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，在體內(nèi)的各軟組織均有表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。根據(jù)編碼GAG鏈結(jié)合區(qū)的mRNA的可變剪接，鑒定出4個(gè)不同的VCAN同工型，分別是V0（370 kD）、V1（263 kD）、V2（180 kD）和V3（74 kD）［8］。研究表明，V1可通過提高表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活性來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［9］，抑制細(xì)胞凋亡［8］。而且，V1同工型可誘導(dǎo)裸鼠的腫瘤生成，在許多惡性腫瘤組織中V1均呈過表達(dá)［10-11］。V2具有與V1截然相反的作用，研究表明，在V2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，EGFR表達(dá)降低，ERK失活，細(xì)胞增殖受抑［10，12-13］。在乳腺癌模型中，VCAN在轉(zhuǎn)錄因子Snail的調(diào)控下高表達(dá)，且硫酸化修飾增加，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［14］。但VCAN在食管鱗癌中的作用尚未見報(bào)道。

異常紡錘體微管裝配體（abnormal spindle microtubule，ASPM）是一種微管負(fù)極端部關(guān)聯(lián)蛋白，該蛋白含有大量IQ結(jié)構(gòu)域，通過結(jié)合大量鈣調(diào)蛋白募集大量鈣離子以促進(jìn)微管形成［15］。研究表明，ASPM在人類癌癥中高表達(dá)，且與不良臨床預(yù)后和早期復(fù)發(fā)有關(guān)。如在卵巢癌、子宮癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、淋巴結(jié)癌和胃癌等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)［15］。此外，ASPM可作為預(yù)測肝細(xì)胞癌浸潤、轉(zhuǎn)移潛能，早期腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高和預(yù)后不良的標(biāo)志［16］。但ASPM在食管鱗癌中的作用尚未見報(bào)道。

KIF20是驅(qū)動(dòng)蛋白超家族的一員，主要參與有絲分裂過程中紡錘體的組裝［17-19］。越來越多的研究表明，KIF20A在多種人類惡性腫瘤（包括膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、頭頸癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤）中表達(dá)上調(diào)［20-26］，并參與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、侵襲和遷移，可作為癌癥預(yù)后的生物標(biāo)志物。如在胰腺導(dǎo)管腺癌中沉默KIF20A可顯著降低胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的增殖和遷移［27］。但KIF20A在食管鱗癌中的作用尚未見報(bào)道。

綜上所述，食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過生物信息學(xué)方法篩選得到的食管鱗癌核心基因VCAN、ASPM、KIF20A在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，但它們在食管鱗癌中的作用尚未見報(bào)道。本研究表明，VCAN、ASPM、KIF20A這3個(gè)核心基因在食管鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，提示它們可能對食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。本研究為今后進(jìn)一步分析這些核心基因在食管鱗癌中的作用及其機(jī)制提供了一定的依據(jù)，也為食管鱗癌的分子診斷和精準(zhǔn)靶向治療奠定了基礎(chǔ)。