胡媛媛，劉子琦，喬子祺，陳欣，尹華雯，姚波，2

1.重慶科技學院化學化工學院，重慶401331；

2.工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點實驗室，重慶401331

由于傳統(tǒng)抗生素的過度使用和濫用，細菌耐藥性在世界范圍內(nèi)引起嚴重的健康問題，尋找新的有效抗生素變得越來越困難。在這種情況下，抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）提供了一種很有前景的對抗多種病原微生物的策略，既可直接作為抗菌劑，又可作為天然免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子［1-2］。AMP又稱宿主防御肽，是幾乎所有生物體先天免疫的一部分，具有陽離子性（帶正電）和兩親性（親水和疏水）［3］。陽離子AMP能與帶負電荷的細菌細胞膜結(jié)合，導致細菌細胞膜上電化學電位變化，引起細胞膜損傷并使蛋白質(zhì)等內(nèi)容物泄漏，出現(xiàn)空泡化；通過破壞細胞膜迅速殺死入侵的病原體，使病原體很難產(chǎn)生耐藥性［4-6］。

Hepcidin是一種AMP和鐵調(diào)節(jié)激素，在宿主的先天免疫和鐵代謝中起雙重作用，主要由肝臟產(chǎn)生并釋放至血清中［7］。Hepcidin在控制體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，其通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用，誘導其內(nèi)化和降解，從而調(diào)控鐵的穩(wěn)態(tài)。Hepcidin作用廣泛，對革蘭陰性和陽性細菌均有活性，同時還具有抗病毒、抗寄生蟲、抑制真菌和酵母生長等作用。但天然AMP穩(wěn)定性差，半衰期短，毒副作用強，尤其可能具有嚴重的溶血活性［8-9］。

對AMP及其生物功能進行預測能有效幫助了解AMP的作用機理，為設(shè)計穩(wěn)定有效的AMP提供理論依據(jù)。目前主要使用的AMP預測方法，包括基于經(jīng)驗分析的預測方法和基于機器設(shè)計的計算方法［10］，前者是根據(jù)已知AMP序列的生物信息學分析的數(shù)據(jù)［11］，通過優(yōu)化新型AMP理化性質(zhì)、選擇性、溶血活性以及抗菌活性等參數(shù)進行分子設(shè)計；而后者能充分挖掘抗菌活性與生化特性之間的內(nèi)在線性和非線性關(guān)系，適用于復雜模型的大規(guī)模AMP預測［12］。但目前對AMP進行序列優(yōu)化和設(shè)計的方法還存在諸多不足，尚有待進一步改進。為了優(yōu)化AMP的結(jié)構(gòu)，擴大其應(yīng)用，本研究對天然AMP Hepcidin進行生物信息學分析，揭示其潛在的分子機制，同時采用序列模板法設(shè)計優(yōu)化AMP，克服其天然肽的缺點和潛在的問題，為AMP的應(yīng)用研究提供針對性和合理選擇的思路和方案。

1 材料與方法

1.1H epcidin氨基酸序列收集整理 利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：／／www.uniprot.org／）及NCBI的GenBank網(wǎng)站（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov）查找魚類AMP Hepcidin的氨基酸序列，選取斑馬魚中Hepcidin的1個亞類Hepcidin-2（GenBank登錄號：Q7T273）作為目的基因，并通過Tblastn（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）進行多序列同源性比對得到Hepcidin基因家族的核苷酸序列和氨基酸序列。

1.2H epcidin氨基酸序列的生物信息學分析 利用ProtParam蛋白質(zhì)在線分析網(wǎng)站（http：／／web.expasy.org／protparam／），計算預測氨基酸等電點、疏水性等，同時利用網(wǎng)站http：／／web.expasy.org／prootscale.htmL／畫出蛋白質(zhì)的疏水性圖譜。運用InterPro在線分析工具（http：／／www.ebi.ac.uk／interpro／），分析得到蛋白質(zhì)信號肽N-末端、C-末端、H區(qū)組成部分位點。運用SignalP-5.0 Server在線預測軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP）預測其可能存在的切割位點。運用TMHMM 2.0在線跨膜結(jié)構(gòu)分析工具（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）預測分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)：基于HMM方法的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)，結(jié)合TMpred分析跨膜核心位點。運用PSIPRED（http：／／bioinf.cs.ucl.ac.uk／psipred／）和Phyre在線分析軟件（http：／／www.sbg.bio.ic.ac.uk／phyre2／ht／page）預測二級結(jié)構(gòu)，運用Phyre在線分析軟件預測三級結(jié)構(gòu)。

1.3AM P H epcidin序列模板設(shè)計 收集人、家鼠、尼羅羅非魚、斑馬魚、褐家鼠、歐洲舌齒鱸、大西洋白姑魚、大菱鲆、尖齒胡鯰及大黃魚等物種產(chǎn)生的Hepcidin AMP序列，篩選出152條氨基酸長度為80～99 aa的序列。比對后計算每種氨基酸在任意位置出現(xiàn)次數(shù)以及比對空格出現(xiàn)的次數(shù)，并由此計算氨基酸的頻率。提取最大頻率的氨基酸，得到序列模板。

1.4AM P H epcidin活性預測

1.4.1AntiBP2預測 AntiBP是采用支持向量機首先分別對N-末端和C-末端15個殘基的二進制模式進行AMP預測；其次對N&C-末端殘基進行預測；最后利用全肽的氨基酸組成建立基于支持向量機的模型。使用五重交叉驗證技術(shù)開發(fā)所有模型，并在獨立數(shù)據(jù)集上測試模型性能，開發(fā)出AntiBP2服務(wù)器，有助于發(fā)現(xiàn)有效的AMP［13］。

1.4.2DBAASP預測 DBAASP是研究結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系所需信息的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫提供信息和資源分析，以促進設(shè)計具有高治療指數(shù)的抗菌藥物。DBAASP搜索頁面允許用戶根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征、復雜類型（單體、二聚體和雙肽）、來源、合成類型（核糖體、非核糖體和合成）和目標物種來搜索多肽［14］，可預測提交的蛋白序列對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌等7種細菌和人紅細胞的活性。

1.4.3Antifp預測 Antifp是利用多種肽特征（如氨基酸組成、二元模型和末端殘基等）開發(fā)的用于預測抗真菌肽（antifungal peptide，AFP）的計算機模型。通過殘基位置偏好分析揭示了N-末端特定殘基類型（如R、V、K）和C-末端特定殘基類型（如C、H）的突出。在成分相似的AFP和非AFP的數(shù)據(jù)集上對開發(fā)的模型和現(xiàn)有方法進行基準測試，在測試數(shù)據(jù)集和驗證數(shù)據(jù)集上有較高的準確率，所建立的二元模型有更好的預測性能［15］。

2 結(jié)果

2.1魚類AM PHepcidin基因家族的進化Hepcidin-2的開放閱讀框編碼91個氨基酸，序列N-末端由M（Met）氨基酸開始。該序列包含了Hepcidin-2 AMP全長開放閱讀框序列，推測基因組DNA包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。Hepcidin-2氨基酸序列中1~24位為信號肽、25~64位為前肽、67~91位為活性肽，二硫鍵的位置分別為

對魚類Hepcidin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，分為3大支，大西洋鯡魚單獨形成1支，斑馬魚與黃鰭結(jié)魚、金線鲃、鯽魚、草魚、鱸鯉、多鱗白甲魚、理氏裂腹魚、鳙魚、鰱魚、泥鰍、武昌魚及南亞野鯪為1大支，另1大支由電鰻、巴丁魚、梭子魚、海鱒、細鱗鮭、哲羅鮭、紅鮭魚、銀大麻哈魚、虹鱒、北極嘉魚、烏塘鱧、大鰭彈涂魚、舌齒鱸、蘭副雙邊魚、華美達魚、大黃魚、淞江鱸、紅腹羅非魚、斑馬擬麗魚、白邊鋸鱗魚及長印魚等物種組成。收集的魚類AMPHepcidin基因家族進化分析發(fā)現(xiàn)，斑馬魚與南亞野鯪Hepcidin序列相似性最高，為72.22%，與大西洋鯡魚的進化關(guān)系最遠，相似性為46.15%。見表1。

圖1 魚類AMP Hepcidin基因家族進化分析Fig.1 Evolutionary analysis of fish AMP Hepcidin gene family

表1 不同物種與斑馬魚Hepcidin AMP氨基酸序列相似性Tab.1 Homologies of amino acid sequences of Hepcidin AMPs from zebrafish and other species

2.2Hepcidin氨基酸序列的生物信息學分析結(jié)果

2.2.1氨基酸序列理化性質(zhì)分析結(jié)果 AMP Hepcidin-2序列由91個氨基酸組成，ProtParam在線分析結(jié)果顯示，其分子式為C459H731N131O130S11，相對分子質(zhì)量為10 517.31，理論等電點為7.55，總的負電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）=9，總的正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）=10。該分子的脂肪族指數(shù)為88.79，親水性總平均值為0.041，不穩(wěn)定性指數(shù)為42.82，高于閾值40，為疏水性不穩(wěn)定蛋白。AMP疏水性圖譜見圖2，在5~24位氨基酸之間，Score>1.5，呈現(xiàn)明顯的疏水性，預測與信號肽有關(guān)。

圖2 Hepcidin-2 AMP疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity of Hepcidin-2 AMP

2.2.2信號肽分析結(jié)果 真核生物中，信號肽通常在指導蛋白質(zhì)插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜后被信號肽酶切割。蛋白質(zhì)中的信號肽可大致分為3類：Sec信號肽（Sec／SPⅠ）、脂蛋白信號肽（Sec／SPⅡ）及Tat信號肽（Tat／SPⅠ）。InterPro在線分析工具分析顯示，Hepcidin-2信號肽中1~5位氨基酸為N-末端信號肽，6~19位氨基酸為功能區(qū)，20~24位氨基酸為C-末端信號肽，見圖3。SignalP-5.0 Server在線預測分析結(jié)果顯示，其切割位點在Ala24和Val25之間，為Sec信號肽，被SPaseⅠ裂解，見圖4。

圖3 Hepcidin-2信號肽功能區(qū)分析Fig.3 Analysis of functional domain of Hepcidin-2 signal peptide

圖4 Hepcidin-2 AMP信號肽分析結(jié)果Fig.4 Analysis of Hepcidin-2 AMPsignal peptide

2.2.3跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 通過2.2.2項對氨基酸序列的分析可知，1~24位為信號肽序列。信號肽引導多肽分子穿過細胞質(zhì)膜，其位置與TMHMM 2.0分析顯示的跨膜螺旋區(qū)域（Tm-helix）重合，分析結(jié)果中7~29位氨基酸形成跨膜螺旋區(qū)。同時，通過TMpred法，基于對Tmbase數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計分析來預測跨膜方向，Score＞500被認為有生物學意義，結(jié)果顯示，預測膜外到膜內(nèi)的跨膜螺旋1個，由3~22位氨基酸形成，中心位點為13，預測分數(shù)為1 990，無偏好性；預測膜內(nèi)到膜外的跨膜螺旋1個，由6~28位氨基酸形成，中心位點為18，預測分數(shù)為2 287，具有偏好性，由此可知，跨膜螺旋方向偏向由膜內(nèi)向膜外。見圖5。

圖5 Hepcidin-2 AMP跨膜區(qū)分析Fig.5 Analysisof transmembrane region of Hepcidin-2 AMP

2.2.4二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果 Phyre分析工具預測結(jié)果見圖6，Hepcidin-2蛋白序列存在3處α-螺旋富集區(qū)，主要集中位于信號肽部分，有較高的置信度；1處β-折疊區(qū)域，集中位于成熟肽部分，序列中有35%的區(qū)域在數(shù)據(jù)庫無適合的匹配，因此為無規(guī)則狀態(tài)，在圖中以“？”表示。

圖6 Hepcidin-2 AMP二級結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Secondary structure of Hepcidine-2 AMP

2.2.5三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果 根據(jù)提交的Hepcidin-2氨基酸序列，Phyre在數(shù)據(jù)庫中匹配到最高評分，以該最高評分為模板建模，置信度為98.6%（FoldLibraryid：c1s6wA），保守度為22%（包含20個氨基酸），一致性為70%。成熟肽區(qū)域預測分析顯示73~76、78、88~90位氨基酸保守性最高，為穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊。線性置信度在73~80、85~87、88~91位最高。在AMP活性中心位置，空間結(jié)構(gòu)高度保守，見圖7。

圖7 Hepcidin-2 AMP三級結(jié)構(gòu)預測模型Fig.7 Model for prediction of tertiary structure of Hepcidin-2 AMP

2.3序列模板設(shè)計結(jié)果

2.3.1序列比對結(jié)果 經(jīng)序列比對后確定結(jié)構(gòu)域序列，序列C-末端具有較高的相似性，表明Hepcidin AMP保守性較高，不同物種Hepcidin AMPC-末端大多存在6~8個Cys，形成3~4對二硫鍵，具有高度保守性。鑒于肽段的序列較長，因此僅分析活性肽功能區(qū)序列。為確保功能區(qū)結(jié)構(gòu)域的完整性，選取序列比對格式中序列C-末端36位氨基酸，見表2。

表2 序列比對后選取的Hepcidin功能區(qū)序列（部分數(shù)據(jù)）Tab.2 Sequences of functional domains of Hepcidin screened after sequence alignment（partial data）

2.3.2功能區(qū)氨基酸分布頻率 根據(jù)比對后的序列，統(tǒng)計每種氨基酸在相應(yīng)位置出現(xiàn)的次數(shù)，以及序列比對中空格（由“-”表示）出現(xiàn)的次數(shù)。根據(jù)統(tǒng)計的次數(shù)，計算各氨基酸在特定位置出現(xiàn)的頻率，其中超過0.05的數(shù)據(jù)用陰影表示。結(jié)果顯示，在14、17、18、20、21、30等位置半胱氨酸出現(xiàn)頻率均≥78%，表明這些位置具有高度保守性，同時在26、27、29、31位半胱氨酸占比最大；在8~12、34~36位空格的頻率≥72%。因此，在最終序列模板里，這些位置將與斑馬魚Hepcidin-2進行比較分析后選擇性去除。見表3。

2.3.3序列模板 提取表格中最大頻率的氨基酸，得到序列模板為：KRRIH--------CRFCCGCCRNGKCCGCCCF----。按照同樣方法，不計算空格的序列模板為：KRRIHHPSSSPKLCRFCCGCCRNGKCCGCCCFFFGF。將兩種序列模板與斑馬魚的Hepcidin-2（GenBank登錄號：Q7T273）比對，調(diào)整序列模板，取序列比對最高分數(shù)的Hepcidin模板（Hepcidin Template，HepTP）：KRRIHHSLCRFCCGCCRNGKCCGCCCF。

將模板序列與斑馬魚Hepcidin-2進行對比，Hepcidin-2中的半胱氨酸均能被匹配，同時模板序列多出2個半胱氨酸，使得兩段序列的不穩(wěn)定性指數(shù)由52.16降至43.35，其他性質(zhì)差異還有待進一步驗證。

根據(jù)序列比對最高分數(shù)的模板整理各位置頻率前3的氨基酸，見圖8。

圖8 氨基酸頻率分布圖Fig.8 Distribution of amino acid frequencies

2.4抗菌活性預測結(jié)果與分析

2.4.1AntiBP2預測結(jié)果 Hepcidin-2模板序列從第1個位置起具有抗菌活性，屬于Hepcidin類AMP，預測分數(shù)為0.813，預測分數(shù)是通過加法矩陣，將每個殘基在肽序列特定位置的分數(shù)相加來計算。

2.4.2DBAASP預測結(jié)果 陽性預測值（positivepredictive value，PPV）表示預測為活性肽，陰性預測值（negative predictive value，NPV）表示為非活性肽。對人紅細胞活性的評價，非活性肽被認為是陽性，因此非人類紅細胞活性肽表示PPV，反之為NPV。Hepcidin-2模板的預測結(jié)果為對肺炎克雷伯菌有抗菌活性和人紅細胞有溶血活性。見表4。

表4 Hepcidin-2模板序列在Dbaasp預測的結(jié)果Tab.4 Prediction of Hepcidin-2 template sequence by Dbaasp software

2.4.3Antifp預測結(jié)果 Hepcidin-2模板具有抗真菌的活性，機器學習算法根據(jù)預測模型給出的分數(shù)為1.281，凈電荷為7。

表3每種氨基酸在任一位置的頻率（%）Tab.3 Frequencies of each amino acid in various positions（%）

3 討論

本研究選取斑馬魚Hepcidin-2基因為研究對象，分析了其進化關(guān)系、理化性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)等。

Hepcidin AMP由信號肽、前肽和成熟肽3部分組成。信號肽使AMP從細胞內(nèi)分泌出來，前肽保護自身免受酶解并保持生物活性；其抗菌作用最終體現(xiàn)在成熟肽中［16］。信號肽通常為16~30個氨基酸殘基，一般由一段高度疏水的氨基酸序列組成，位于分泌蛋白和膜蛋白的N-末端，包括3個區(qū)域：N-末端，帶正電的堿性氨基末端；H區(qū)，以中性氨基酸為主的一段α-螺旋結(jié)構(gòu)，是信號肽主要功能區(qū)；C-末端帶負電，具有信號肽酶切割位點［17］。斑馬魚Hepcidin-2蛋白序列是由24個氨基酸組成的信號肽，位于Hepcidin AMPN-末端并具有疏水性；在跨膜區(qū)域中，信號肽的N-末端插入膜內(nèi)，其中間功能區(qū)和C-末端呈螺旋結(jié)構(gòu)跨膜區(qū)域；整體序列帶正電，屬于堿性陽離子疏水性AMP。AMP的作用機理取決于許多理化性質(zhì)，包括氨基酸序列、電荷、雙親性、結(jié)構(gòu)尤其是二級結(jié)構(gòu)等。盡管AMP具有適當?shù)睦砘匦?，研究人員仍認為其與細菌膜結(jié)合的能力在研究和應(yīng)用中起著關(guān)鍵作用［18］。SHEN等［19］計算Hepcidin成熟肽區(qū)域中，多肽空間結(jié)構(gòu)含32%的β-折疊結(jié)構(gòu)和8個半胱氨酸殘基組成的4個二硫鍵，形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。另有個例僅存在4個半胱氨酸，發(fā)現(xiàn)于南極的物種中，有研究認為極端的天氣，如寒冷可能導致Hepcidin進化，減少半胱氨酸數(shù)量以適應(yīng)外界環(huán)境［20］。半胱氨酸的側(cè)鏈上有活潑的巰基，一般情況下不會被其他任何氨基酸取代，因此具有保守性。半胱氨酸通過空間約束改變二級結(jié)構(gòu)，形成的二硫鍵橋可穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)，其拓撲結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)同源性分析的基礎(chǔ)［21］。

斑馬魚Hepcidin-2蛋白成熟肽三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，其置信度為98.6%，保守度為22%（包含20個氨基酸），一致性為70%。在AMP活性中心位置，空間結(jié)構(gòu)高度保守。對編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析中，在N-末端主要為α-螺旋，C-末端集中為β-折疊。經(jīng)計算得到的序列模板的抗菌活性預測結(jié)果顯示，其具有抗肺炎克雷伯菌和抗真菌活性及其對人類紅細胞毒性。

在任一蛋白序列中，每種氨基酸在任意位置的隨機分布頻率約5%，顯著高于或低于該頻率值表示該位置對給定氨基酸的偏好或不相容，這些氨基酸可能是通過進化選擇的，因此與肽的功能有關(guān)［22］。本研究采用的序列模板法，提取各位置頻率最大的氨基酸組成模板正符合這一規(guī)律。

序列模板法除了可用于指導SAR（structureactivity relationship）研究中AMP設(shè)計之外，還可用于在數(shù)據(jù)庫中搜索具有潛在抗菌活性的新序列。ZELEZETSKY等［22］使用ScanProsite工具用模板掃描Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，在Pilosulin 1中鑒定出1個含有56個殘基的片段，該片段是來自跳投蟻（Myrmeciapilosula）毒液的細胞毒性肽，與模板密切相關(guān)。該片段N-末端20個殘基顯示出有效的廣譜抗菌活性，其抗菌譜包括耐多藥的和普通的革蘭陽性、陰性菌以及白色念珠菌，證實了該搜索方法的有效性。

在序列模板法的基礎(chǔ)上，通過單個氨基酸殘基取代，研究調(diào)節(jié)取代位氨基酸的性質(zhì)進行選擇性的優(yōu)化，而同時又不影響對多種耐藥細菌和酵母指示菌株的抗菌活性，從最小抑菌濃度、膜透性動力學和對紅細胞裂解等方面討論結(jié)構(gòu)特征（側(cè)鏈的大小／疏水性以及構(gòu)象和靈活性）和生物活性之間的關(guān)系［23］。使用蛋白氨基酸各種參數(shù)的計算來進行肽的設(shè)計，這一原理可開發(fā)有效且降低細胞毒性的AMP。該方法通用性強，允許使用非蛋白殘基的取代，明顯擴展了物理化學和結(jié)構(gòu)變化的范圍，以調(diào)整生物特性。

研究表明，改變關(guān)鍵位置的氨基酸殘基可調(diào)節(jié)側(cè)鏈尺寸、疏水性等特性，以及主鏈在此位置的構(gòu)象和柔韌性。ZELEZETSKY等［23］設(shè)計的AMP類似物中，將第7位氨基酸由蛋白源性Gly、Pro、非蛋白源性β-Ala、D-Nle氨基酸、STA或PST模塊（modules）取代，以此調(diào)節(jié)蛋白特性及主鏈的構(gòu)象。在50%TFE或模擬SDS膠束的膜存在下，均顯示出良好的結(jié)構(gòu)水平；在抑菌活性試驗中所有肽對測試微生物均具有廣譜活性，最小抑菌濃度為8μmol／L甚至更低。非蛋白源性肽對大腸埃希菌的內(nèi)外膜均顯示出快速的通透性，所有蛋白源肽均顯示出對大腸埃希菌外膜的通透性，而僅非蛋白源性肽Ala7和蛋白源肽Gly7取代對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的細胞質(zhì)膜有明顯通透性。由此，提出了調(diào)節(jié)AMP使細菌裂解的方法，并通過影響最小的氨基酸替換使其對微生物細胞更具特異性。

本研究建立了運用序列模板法優(yōu)化AMP的技術(shù)路線，可為預測其抗菌活性和細胞毒性提供參考，有助于改造天然AMP，根據(jù)特定情況有針對性地設(shè)計肽，調(diào)節(jié)不同肽的活性，為擴大其在臨床和生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支持和技術(shù)支撐。