宋麗茹，孫晨，馬佳樂，楊濱，郭睿，閆萍

1.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西太原030001；

2.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，山西太原030002

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種致死率較高的心血管疾病［1］，再灌注能夠有效減少AMI梗死面積，但再灌注本身可加重心肌損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）［2］。缺血組織快速恢復(fù)血流引起氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3］。上述研究表明，減少AMI早期梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡可明顯降低MIRI的發(fā)生，是治療AMI的主要研究方向之一。

Canopy2（Canopy FGFsignalingregulator2，CNPY2）由182個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約21 000［4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，降低CNPY2可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加［5］。同時(shí)，有報(bào)道表明，心臟特異性過表達(dá)CNPY2能降低擴(kuò)心病小鼠模型心肌細(xì)胞凋亡［6］。因此，推測(cè)CNPY2可能也與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，而CNPY2是否參與MIRI早期心肌細(xì)胞凋亡尚不明確。多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）是一種與細(xì)胞損傷密切相關(guān)的酶，可作為死亡底物參與細(xì)胞凋亡的過程。本研究通過大鼠MIRI模型分析MIRI后早期心肌組織中CNPY2的表達(dá)水平，且于大鼠體內(nèi)體外分別過表達(dá)外源性CNPY2，初步探討CNPY2對(duì)MIRI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1病毒及細(xì)胞 Ade-GFP、攜帶人CNPY2基因（hCNPY2）的腺病毒Ade-hCNPY2-Flag和陰性對(duì)照腺病毒Ade-NC-Flag由生工生物工程（上海）股份有限公司構(gòu)建；H9c2細(xì)胞由山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫提供。

1.2主要試劑 異氟烷購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技公司；Protease Inhibitor Cocktail及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗CNPY2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus公司；兔抗PARP單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；FBS購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司；Hoechst染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；蛋白激酶K工作液購(gòu)自北京Solarbio公司；DAB工作液購(gòu)自上?；蚩萍加邢薰尽?/p>

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)SD大鼠，雌性，6~8周齡，體重200~250 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK（晉）2015-0001。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液，0.25%胰酶消化，進(jìn)行傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5腺病毒M OI及感染時(shí)間的確定 將Ade-GFP按不同MOI（40、50、80、100、150）感染H9c2細(xì)胞，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，確定最適病毒MOI。以最適MOI感染H9c2細(xì)胞，相同條件連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。

1.6CN P Y2蛋白的過表達(dá) 將Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag按最適MOI分別感染H9c2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（未感染的H9c2細(xì)胞），于37℃感染48 h后，用0.5%NP-40蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用10%脫脂牛奶于室溫封閉1 h；加入兔抗CNPY2多克隆抗體和小鼠抗GAPDH單克隆抗體（均1∶1 000稀釋），于4℃孵育過夜；用TBST洗滌3次，每次10 min，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（均1∶1 000稀釋），室溫孵育1 h；ECL法顯色。同時(shí)檢測(cè)Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag感染H9c2細(xì)胞2、4、6、8 d后，細(xì)胞中CNPY2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，方法同上。

1.7過表達(dá)CN P Y2對(duì)體外缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡影響的檢測(cè) 用腺病毒Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag感染第3代H9c2細(xì)胞，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；將H9c2細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)50%~80%時(shí)，將細(xì)胞置37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%FBS）培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入H2O2（300μmol／L，2.5 h）氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡；棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，用固定液固定10 min；棄固定液，PBS洗滌2次，加入Hoechst 33258染色液，避光靜置5 min；棄染液，PBS洗滌2次，滴加抗熒光淬滅封片液進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。同時(shí)，采用Western blot法檢測(cè)PARP蛋白的表達(dá)水平，方法同1.6項(xiàng)，其中一抗為兔抗PARP單克隆抗體，稀釋度為1∶1 000。

1.8CN P Y2在大鼠心肌細(xì)胞中的定位 取大鼠心臟，將心臟組織置福爾馬林溶液固定，制備2μm石蠟組織切片，透明，脫水，檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)，用20%山羊血清封閉，加入兔抗CNPY2多克隆抗體（1∶1 000稀釋），于4℃孵育過夜；PBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000稀釋），室溫作用30 min；PBST洗滌3次，每次10 min，進(jìn)行細(xì)胞核DAPI染色，封片，拍照，觀察CNPY2在細(xì)胞中的定位。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（未滴加一抗）。

1.9大鼠M I R I心肌細(xì)胞中CN P Y2表達(dá)水平的檢測(cè)SD大鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉，氣管插管，維持氣管通氣。左胸部第三四肋骨間打開胸腔，暴露心臟，用手術(shù)針線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，打活結(jié)，即刻給予Adeh-CNPY2-Flag心肌注射（100μL／200 g體重），60 min后去除結(jié)扎，恢復(fù)血供，完成再灌注。同時(shí)設(shè)假手術(shù)組（不注射病毒，僅手術(shù)）。取大鼠假手術(shù)組及再灌注后1、4、7 d組心臟組織的梗死及邊緣區(qū)部分，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中CNPY2蛋白的表達(dá)水平，方法同1.6項(xiàng)，以確定再灌注的最適時(shí)間。

1.10CN P Y2對(duì)大鼠M I R I心肌細(xì)胞凋亡影響的檢測(cè)1.10.1TUNEL染色 按1.9項(xiàng)處理大鼠，分別給與Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag注射，于再灌注4 d，取兩組大鼠心臟，制備為4μm的石蠟組織切片，脫水，加入蛋白激酶K工作液（20μg／mL），于37℃孵育20 min；PBS洗滌2次，兩組均滴加反應(yīng)液（TUNEL試劑盒中Enzyme Solution 5μL+Label Solution 45μL混合液），同時(shí)設(shè)相應(yīng)對(duì)照組（滴加50μL Label Solution），37℃暗濕孵育60 min；PBS洗滌3次，滴加50μL converter-POD，37℃濕孵育30 min；PBS洗滌3次，滴加50μL DAB工作液，室溫放置1~5 min；染色后樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.10.2Western blot檢測(cè) 同1.10.1項(xiàng)處理小鼠，于再灌注4 d，取兩組大鼠心臟組織，迅速加入液氮，研磨成粉末，用蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。取50μg蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，Western blot法（同1.6項(xiàng)）檢測(cè)PARP蛋白表達(dá)水平。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用ImageJ 2軟件分析圖像，Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1最適M OI及感染時(shí)間 MOI=50時(shí)，熒光顯微鏡下綠色熒光最多，見圖1，因此確定H9c2細(xì)胞的最佳MOI為50。以MOI=50進(jìn)行細(xì)胞感染，感染6 d時(shí)還可見部分細(xì)胞存在綠色熒光，感染8 d時(shí)綠色熒光明顯減少，見圖2。因此確定感染后1周內(nèi)為最適感染時(shí)間。

圖1 不同MOI感染H9c2細(xì)胞的鏡下觀察（×100）Fig.1 Microscopy of H9c2 cells infected at various MOIs（×100）

圖2 不同感染時(shí)間H9c2細(xì)胞的鏡下觀察（×100）Fig.2 Microscopy of H9c2 cells infected for various days（×100）

2.2CN P Y2蛋白的過表達(dá) 以MOI=50感染，空白對(duì)照組、Ade-hCNPY2-Flag組和Ade-NC-Flag組H9c2細(xì)胞中CNPY2蛋白表達(dá)水平分別為0.050、2.271、0.057，Ade-hCNPY2-Flag組明顯高于空白對(duì)照組及Ade-NC-Flag組（t分別為6.232和5.717，P<0.05），見圖3。Ade-hCNPY2-Flag感染細(xì)胞后CNPY2蛋白表達(dá)水平逐漸升高，感染后4 d達(dá)最高，隨后逐漸下降，但與Ade-NC-Flag比較，感染后2、4、6、8 d時(shí)，Ade-hCNPY2-Flag組中CNPY2蛋白表達(dá)水平明顯升高（t分別為16.26、15.69、8.334、5.508，P分別為<0.01、0.01、0.05、0.05），見圖4和圖5。

圖3 Western blot法檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞中CNPY2蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Western blotting of CNPY2 expressed in H9c2 cells of various groups

圖4 Western blot法檢測(cè)不同感染時(shí)間H9c2細(xì)胞中CNPY2蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Western blotting of CNPY2 protein expressed in H9c2 cells infected for various days

圖5 不同感染時(shí)間H9c2細(xì)胞中CNPY2蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of CNPY2 protein in H9c2 cells infected for various days

2.3過表達(dá)CN P Y2對(duì)體外缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響 Ade-NC-Flag+H2O2組和Ade-hCNPY2-Flag+H2O2組在一個(gè)視野下平均細(xì)胞凋亡率分別為17.61和7.250，表明過表達(dá)CNPY2可顯著降低細(xì)胞凋亡率（t=5.147，P<0.05），見圖6。Ade-NCFlag+H2O2組和Ade-hCNPY2-Flag+H2O2組細(xì)胞凋亡蛋白PARP的活性分別為0.583和0.269，表明過表達(dá)CNPY2蛋白可顯著降低細(xì)胞凋亡蛋白PARP的表達(dá)水平（t=6.325，P<0.01），見圖7。

圖6 Hoechst33258染色法檢測(cè)過表達(dá)CNPY2后H9c2細(xì)胞的凋亡情況（×200）Fig.6 Determination of apoptosis of H9c2 cells after CNPY2 overexpression by Hoechst33258 staining（×200）

圖7 過表達(dá)CNPY2對(duì)H9c2細(xì)胞中PARP蛋白表達(dá)水平的影響Fig.7 Effectof CNPY2 overexpression on PARPprotein expression level in H9c2 cells

2.4CN P Y2的定位 CNPY2在心肌細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，見圖8。

圖8 CNPY2在心肌細(xì)胞中的表達(dá)（×400）Fig.8 Expression of CNPY2 in cardiomyocytes（×400）

2.5大鼠M I R I心肌細(xì)胞中CN P Y2的蛋白表達(dá)水平假手術(shù)組及再灌注后1、4、7 d過表達(dá)組大鼠心肌細(xì)胞中CNPY2蛋白的表達(dá)水平分別為0.726、0.304、0.220、0.618。與假手術(shù)組比較，再灌注后過表達(dá)組1、4、7 d大鼠心臟梗死及邊緣區(qū)組織中CNPY2的表達(dá)水平均明顯降低（t分別為11.57、25.06、3.639，P分別<0.01、<0.001、<0.05），CNPY2的表達(dá)水平在再灌注1周內(nèi)顯著降低，第4天時(shí)尤為明顯。見圖9。

圖9 Western blot法檢測(cè)大鼠MIRI心肌細(xì)胞中CNPY2蛋白的表達(dá)Fig.9 Determination of CNPY2 expression in cardiomyocytes of rats with MIRIby Western blot

2.6CN P Y2對(duì)大鼠M I R I心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.6.1TUNEL染色 Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NCFlag組的細(xì)胞凋亡率分別為0.570和1.442，前者明顯低于后者（t=9.947，P<0.01），見圖10。表明對(duì)大鼠缺血心臟給予外源性CNPY2后，可明顯抑制MIRI的發(fā)生。

圖10 各組大鼠MIRI早期心肌凋亡情況的鏡下觀察（×400）Fig.10 Microscopy of myocardium apoptosis at early stage of MIRI（×400）

2.6.2Western blot檢測(cè) Ade-hCNPY2-Flag和Ade-NC-Flag組PARP蛋白表達(dá)水平分別為0.570和1.442，前者明顯低于后者（t=9.947，P<0.01），見圖11。表明缺血后過表達(dá)CNPY2對(duì)MIRI誘導(dǎo)的早期心肌凋亡可發(fā)揮顯著保護(hù)作用。

圖11 大鼠MIRI心肌細(xì)胞中PARP蛋白的表達(dá)水平Fig.11 Expression level of PARP in cardiomyocytes of rats with MIRI

3 討論

MIRI的發(fā)生機(jī)制涉及多種病理生理行為，包括氧自由基的大量產(chǎn)生、鈣超載、細(xì)胞凋亡、心肌能量代謝障礙等因素共同參與［7］。其中氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡是MIRI中的重要環(huán)節(jié)。心肌由終末分化的心肌細(xì)胞組成，其負(fù)責(zé)心臟泵功能，成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞幾乎無再生能力，而過度的心肌細(xì)胞死亡，心臟會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重且持久的病理學(xué)效應(yīng)［8］。細(xì)胞凋亡是一種高度調(diào)節(jié)的程序性細(xì)胞死亡過程，其中Caspase 3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，一旦被激活，立即發(fā)生下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)接受到凋亡信號(hào)時(shí)，在多種蛋白水解酶的作用下，激活后裂解成活性亞單位，激活的Caspase 3繼續(xù)切割其不同底物，其中PARP是最重要作用底物之一［10］，激活的Caspase 3切割為兩個(gè)裂解片段而失去其正常功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11］。

PARP是一種與細(xì)胞損傷密切相關(guān)的酶，也叫DNA修復(fù)酶，大量存在于真核細(xì)胞中。其中，PARP-1的含量最為豐富，是家族重要成員之一，相對(duì)分子質(zhì)量約為116 000，約占細(xì)胞內(nèi)酶活性的90%，PARP主要參與DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、修復(fù)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和基因調(diào)控等過程［12］。全長(zhǎng)PARP識(shí)別凋亡信號(hào)，可將PARP羧基端的催化結(jié)構(gòu)域（相對(duì)分子質(zhì)量89 000）和氨基端的sbDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（相對(duì)分子質(zhì)量24 000）分離，因此，PARP蛋白的Western blot檢測(cè)可見2條蛋白條帶，分離的越多表明凋亡越嚴(yán)重。PARP剪切是細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)之一，通常認(rèn)為是Caspase 3激活的指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，MOI=50時(shí)，H9c2細(xì)胞感染效果最佳，感染1周內(nèi)為最適感染時(shí)效，外源CNPY2-F LAG均高表達(dá)。同時(shí)建立過H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡條件，通過細(xì)胞核Hoechst33258染色和West-ern blot檢測(cè)凋亡蛋白PARP，明確CNPY2抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡，提示外源給予CNPY2對(duì)降低心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷后的凋亡具有積極作用。因此，在缺血再灌注早期給予外源CNPY2，可能會(huì)降低MIRI和改善后期心功能。本研究在體內(nèi)進(jìn)行動(dòng)物MIRI的模型制備，經(jīng)免疫熒光追蹤顯示，心肌細(xì)胞是心臟CNPY2主要來源。與假手術(shù)組比較，給予Ade-hCNPY2-Flag的小鼠再灌注7 d內(nèi)心臟梗死及邊緣區(qū)CNPY2的蛋白水平顯著降低（P<0.05），再灌注4 d時(shí)降低最明顯（P<0.001）。在此基礎(chǔ)上，通過腺病毒Ade-hCNPY2-Flag及Ade-NC-Flag分別注射來干預(yù)MIRI心肌早期CNPY2水平，TUNEL染色和Western blot檢測(cè)表明，缺血早期過表達(dá)CNPY2可有效抑制活體大鼠MIRI早期的心肌凋亡。本研究為臨床治療AMI提供了新的靶點(diǎn)和思路，后續(xù)將對(duì)CNPY2保護(hù)心肌MIRI的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。