陳永強(qiáng)，鄭 璐，張 玥，王杜平，程 星，陳艷紅，周忠海，牛國(guó)平▲

1.徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州 221009；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科，江蘇徐州 221004

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一類以脊柱和骶髂關(guān)節(jié)慢性進(jìn)行性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制主要與遺傳、免疫反應(yīng)和微生物感染等有關(guān)[1]。目前研究證實(shí)，人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)與AS發(fā)病具有很強(qiáng)的相關(guān)性，其陽(yáng)性率在AS患者中高達(dá)90%，而在健康人群中陽(yáng)性率僅為2%～7%[2]。有研究報(bào)道，HLA-B27介導(dǎo)TNAP磷酸酶活化促進(jìn)AS中軟骨組織的生成[3]。目前，HLA-B27已成為臨床上輔助診斷AS的重要檢測(cè)指標(biāo)。在HLA-B27的檢測(cè)方法中，流式細(xì)胞術(shù)因其具有檢測(cè)速度快、靈敏度和特異度高等優(yōu)點(diǎn)在臨床上被廣泛應(yīng)用[4]。本研究主要比較美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE檢測(cè)試劑盒和美國(guó)BD公司生產(chǎn)的HLA-B27-FITC/CD3-PE檢測(cè)試劑盒在臨床HLA-B27檢測(cè)過程中影響結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素與異常結(jié)果分析，期望為臨床提供可靠的檢測(cè)報(bào)告。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集來(lái)自徐州市中心醫(yī)院2019年8月至2020年7月門診及住院的1 208例臨床初診為腰椎病、頸椎病、關(guān)節(jié)痛、脊柱僵硬和AS患者的外周血標(biāo)本，采用肝素抗凝管抽取5 mL，所有標(biāo)本均于當(dāng)天應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)完成HLA-B27的檢測(cè)。

1.2儀器與試劑 CytoFLEX流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑盒(貨號(hào)：340183)和溶血素(貨號(hào)：349202)為美國(guó)BD公司生產(chǎn)；HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE試劑盒(貨號(hào)：A07739)和溶血素(貨號(hào)：A11895)為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法 向編號(hào)的檢測(cè)管中依次加入10 μL檢測(cè)抗體和50 μL肝素抗凝外周血，振蕩混勻后置于室溫避光處孵育20 min，然后每管加入0.5 mL貨號(hào)為A11895溶血素，混勻避光孵育15 min，加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液，避光孵育平衡5 min，每管加2 mL磷酸鹽緩沖液，1 600 r/min離心5 min，棄掉上清液，每管加0.5 mL磷酸鹽緩沖液，振蕩混勻后采用CytoFLEX流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)分析。

1.3.2HLA-B27-FITC/CD3-PE檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法 向編號(hào)的檢測(cè)管中依次加入10 μL檢測(cè)抗體和50 μL肝素抗凝外周血，振蕩混勻后置于室溫避光處孵育20 min，隨后加入1 mL貨號(hào)為349202的溶血素，渦旋振蕩混勻后避光5 min，每管加入1 mL磷酸鹽緩沖液混勻后1 600 r/min離心5 min，棄上清液，再用2 mL磷酸鹽緩沖液洗滌1次后，加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液，振蕩混勻后采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩種試劑盒檢測(cè)原理 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE檢測(cè)試劑盒主要通過FSC和SSC雙參數(shù)圖圈定淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門，然后分析淋巴細(xì)胞中 HLA-B7-HLA-B27+細(xì)胞群的百分比，比例≥90%判讀為陽(yáng)性，見圖1；美國(guó)BD公司生產(chǎn)的HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑盒首先通過FSC和SSC雙參數(shù)圖圈定淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門，然后分析淋巴細(xì)胞群中CD3+淋巴細(xì)胞中HLA-B27的平均熒光強(qiáng)度，通過試劑盒自設(shè)平均熒光強(qiáng)度(MFI)臨界值≥145判讀為陽(yáng)性(不同試劑批號(hào)MFI值略有差異)，見圖2。

注：A為利用FSC和SSC雙參數(shù)顯示的免疫細(xì)胞散點(diǎn)圖，B為對(duì)A圖中圈定的淋巴細(xì)胞分析HLA-B7和HLA-B27表達(dá)水平散點(diǎn)圖。

注：A為利用FSC和SSC雙參數(shù)顯示的免疫細(xì)胞散點(diǎn)圖，B為對(duì)A圖中圈定的淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分析CD3+淋巴細(xì)胞散點(diǎn)圖，C為對(duì)B圖中圈定的CD3+淋巴細(xì)胞分析HLA-B7的表達(dá)強(qiáng)度峰形圖。

2.2淋巴細(xì)胞亞群分群不清晰對(duì)兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞亞群分群不清晰會(huì)導(dǎo)致HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE檢測(cè)試劑盒將HLA-B7-HLA-B27+細(xì)胞群≥90%的陽(yáng)性結(jié)果判讀為陰性結(jié)果(<90%)，見圖3；而HLA-B27-FITC/CD3-PE檢測(cè)試劑盒利用FSC和SSC雙參數(shù)圖圈定淋巴細(xì)胞亞群，同時(shí)繼續(xù)采用CD3-PE抗體進(jìn)一步圈定表達(dá)CD3+淋巴細(xì)胞，可以避免淋巴細(xì)胞亞群分群不清晰導(dǎo)致的假陰性。

注：A、B為初次檢測(cè)中淋巴細(xì)胞分群不清晰HLA-B27的檢測(cè)結(jié)果，A為利用FSC和SSC雙參數(shù)顯示的免疫細(xì)胞散點(diǎn)圖，其中淋巴細(xì)胞群分群質(zhì)量較差，B為對(duì)A圖中圈定的淋巴細(xì)胞分析HLA-B7和HLA-B27表達(dá)水平散點(diǎn)圖；C、D為復(fù)檢中淋巴細(xì)胞分群清晰HLA-B27的檢測(cè)結(jié)果，C為利用FSC和SSC雙參數(shù)顯示的免疫細(xì)胞散點(diǎn)圖，其中淋巴細(xì)胞分群質(zhì)量較好，D為對(duì)C圖中圈定的淋巴細(xì)胞分析HLA-B7和HLA-B27表達(dá)水平散點(diǎn)圖。

2.3HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE試劑盒檢測(cè)HLA-B27異常結(jié)果統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析 采用HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE試劑盒檢測(cè)1 208份標(biāo)本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了標(biāo)準(zhǔn)的陰性標(biāo)本和陽(yáng)性標(biāo)本之外，還存在兩種異常的標(biāo)本類型，異常標(biāo)本1為淋巴細(xì)胞表達(dá)HLA-B7且細(xì)胞群主要分布于第一和第二象限之間；異常標(biāo)本2為淋巴細(xì)胞表達(dá)HLA-B7且細(xì)胞群分布于第二象限或第二和第四象限之間，見圖4。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，陰性標(biāo)本887份，占73.43%；陽(yáng)性標(biāo)本225份，占18.63%；而異常標(biāo)本1共有84份，占6.95%；異常標(biāo)本2共有12份，占0.99%。

注：從左往右依次為陰性標(biāo)本、陽(yáng)性標(biāo)本、異常標(biāo)本1、異常標(biāo)本2。

隨后，筆者對(duì)上述兩種類型的異常標(biāo)本采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的HLA-B27-FITC/CD3-PE檢測(cè)試劑盒進(jìn)行復(fù)測(cè)，結(jié)果顯示，HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE試劑盒檢測(cè)的陰性和陽(yáng)性標(biāo)本與HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致；而異常標(biāo)本1的MFI值介于陰性和陽(yáng)性標(biāo)本的數(shù)值之間，仍然判讀為陰性標(biāo)本；然而，12份異常標(biāo)本2的MFI值均高于陽(yáng)性臨界值145，判讀為陽(yáng)性標(biāo)本，見圖5和表1。

注：從左往右依次為陰性標(biāo)本、陽(yáng)性標(biāo)本、異常標(biāo)本1、異常標(biāo)本2。

表1 兩種試劑盒檢測(cè)HLA-B27結(jié)果比較

2.4HLA-B27檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷之間的關(guān)系 對(duì)1 208份臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷之間的關(guān)系分析結(jié)果顯示，887份HLA-B27陰性標(biāo)本中有32份臨床診斷為AS患者，占3.16%；225份HLA-B7-HLA-B27+淋巴細(xì)胞比例≥90%的陽(yáng)性標(biāo)本中有52份臨床診斷為AS患者，占23.11%；84份異常標(biāo)本1中有1份臨床診斷為AS患者，占1.19%；而12份異常標(biāo)本2中有3份臨床診斷為AS患者，占25.00%，見表2。異常標(biāo)本1臨床檢測(cè)結(jié)果可判讀為陰性，而異常標(biāo)本2存在較高比例的AS患者。

表2 各組標(biāo)本中臨床診斷為AS患者所占比例

3 討 論

流式細(xì)胞術(shù)因?yàn)榫哂锌焖佟㈧`敏度高和特異度高等特點(diǎn)已成為臨床常用檢測(cè)HLA-B27表達(dá)的方法，但是該方法也存在一定的不足之處[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，HLA-B27 的單克隆抗體會(huì)與其他 HLA-B 等位基因編碼的抗原發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)，其中以 HLA-B7抗原的交叉反應(yīng)最常見[6-7]。因此，采用HLA-B27-FITC/CD3-PE兩種抗體組合的試劑檢測(cè)分析CD3+淋巴細(xì)胞表達(dá)HLA-B27時(shí)，對(duì)同時(shí)表達(dá)HLA-B7抗原的標(biāo)本，HLA-B27單克隆抗體會(huì)與HLA-B7抗原發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致一定比例的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果呈假陽(yáng)性；當(dāng)采用HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE雙抗體組合的試劑檢測(cè)分析淋巴細(xì)胞群中HLA-B7-HLA-B27+細(xì)胞的比例時(shí)，可以排除因HLA-B27抗體與HLA-B7抗原交叉反應(yīng)引起的假陽(yáng)性。

在HLA-B27檢測(cè)過程中，經(jīng)常遇到一些可能由于溶血效果不好或細(xì)胞碎片等因素導(dǎo)致上機(jī)檢測(cè)時(shí)淋巴細(xì)胞群分群不清晰的標(biāo)本，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE試劑盒檢測(cè)HLA-B27的方法會(huì)導(dǎo)致部分淋巴細(xì)胞群分群不清晰的陽(yáng)性標(biāo)本被誤判為陰性標(biāo)本，因此該檢測(cè)方法對(duì)淋巴細(xì)胞群分群有較高的要求，對(duì)檢測(cè)過程中遇到分群不清晰的標(biāo)本一定要進(jìn)行復(fù)檢，而HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑盒利用CD3-PE抗體進(jìn)一步圈定表達(dá)CD3+淋巴細(xì)胞，可以避免淋巴細(xì)胞群分群不清晰導(dǎo)致的假陽(yáng)性。HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑盒檢測(cè)方法容易將HLA-B7表達(dá)的標(biāo)本誤判為假陽(yáng)性標(biāo)本，而HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE試劑盒可以將此類標(biāo)本區(qū)分出來(lái)，但對(duì)于淋巴細(xì)胞同時(shí)表達(dá)HLA-B27抗原與HLA-B7抗原的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果仍無(wú)法準(zhǔn)確判斷，這類標(biāo)本結(jié)果的判讀只能結(jié)合病歷資料或與臨床醫(yī)生溝通進(jìn)行判斷。為了能對(duì)本研究中異常標(biāo)本2結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，后期筆者將收集該類標(biāo)本并采用引物特異性聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)對(duì)HLA-B7和HLA-B27的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)[8]，然后結(jié)合臨床診斷進(jìn)一步分析，為今后提高臨床AS患者的診斷率和結(jié)果的可靠性提供依據(jù)。

綜上所述，兩種HLA-B27試劑盒檢測(cè)結(jié)果均準(zhǔn)確可靠；HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE試劑盒能區(qū)分出HLA-B7/HLA-B27雙陽(yáng)性的疑似AS患者，但檢測(cè)過程對(duì)淋巴細(xì)胞亞群分群要求較高；而HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑盒利用CD3設(shè)門可以避免淋巴細(xì)胞亞群分群不清導(dǎo)致的假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，但不能區(qū)分HLA-B7/HLA-B27雙陽(yáng)性標(biāo)本且在結(jié)果判讀中存在一定比例的假陽(yáng)性。