董利陽，徐小衛(wèi)，鄭婷婷，劉佳夢(mèng)，毛朝明

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江 212002

2018年全球腫瘤流行病學(xué)調(diào)查顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在全球惡性腫瘤中排第3位，在腫瘤病死率中排第2位[1]。研究表明，結(jié)直腸癌患者的生存率與疾病分期明顯相關(guān)，Ⅰ～Ⅱ期患者的整體生存率約為90%，Ⅲ期約為71%，Ⅳ期約為14%[2]。顯然，早期發(fā)現(xiàn)對(duì)提高結(jié)直腸癌患者的整體生存率具有重要的臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種長(zhǎng)度大于200 nt且蛋白質(zhì)編碼能力有限的RNA。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在多種類型的腫瘤組織中表達(dá)異常，且影響腫瘤的發(fā)生、癌變和轉(zhuǎn)移[3]。lncRNA亦在血液樣品中穩(wěn)定表達(dá)，顯示出作為新型腫瘤標(biāo)志物的潛能，而將循環(huán)lncRNA作為癌癥診斷的標(biāo)志物已在肺癌、肝癌、乳腺癌中被報(bào)道[4]。lncRNA ELFN1-AS1是一種新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，位于ELFN1基因的反義位置[5]。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者結(jié)腸病灶中l(wèi)ncRNA ELFN1-AS1高表達(dá)，并與患者總生存率降低密切相關(guān)[6]。筆者先前對(duì)22例結(jié)直腸癌患者結(jié)腸和其鄰近組織中l(wèi)ncRNA ELFN1-AS1測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，lncRNA ELFN1-AS1水平在結(jié)直腸癌組織中明顯升高。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ELNF1-AS1的敲除明顯抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)和遷移，提示lncRNA ELFN1-AS1失調(diào)在結(jié)直腸癌發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。本研究旨在探究lncRNA ELFN1-AS1在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)及臨床意義，以期為結(jié)直腸癌的早期診斷提供新策略?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2021年2月于本院胃腸外科和腫瘤科診治的結(jié)直腸癌患者50例作為結(jié)直腸癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理學(xué)檢查明確診斷；(2)為初次診治，無放療、化療及靶向抗癌治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤；(2)既往有結(jié)直腸腫瘤史，并接受抗腫瘤治療；(3)患有精神疾病或存在嚴(yán)重的心、肝、肺等其他重要臟器疾病。收集同期本院體檢健康者40例作為對(duì)照組。結(jié)直腸癌組男30例，女20例；年齡<60歲患者17例，≥60歲33例。對(duì)照組男25例，女15例；年齡<60歲13例，≥60歲27例。結(jié)直腸癌組和對(duì)照組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2儀器與試劑 MolPure?Blood RNA提取試劑盒(上海YEASEN公司)，lncRNA ELFN1-AS1及18S real-time PCR引物(廣州復(fù)能基因公司)，All-in-one First-Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒及All-in-oneTMqPCR Mix實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(廣州復(fù)能基因公司)，NnoDrop ONE微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)，普通PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集所有研究對(duì)象的空腹靜脈血5 mL(結(jié)直腸癌患者于手術(shù)前采集，體檢健康者于體檢時(shí)采集)，置于含促凝膠的真空采血管中，2 000 r/min離心10 min，吸取上層血清置于無RNAse的1.5 mL EP管中并于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時(shí)獲取結(jié)直腸癌患者臨床資料用于分析。

1.3.2血清總RNA的提取 按照MolPure?Blood RNA試劑盒說明書提取血清總RNA，簡(jiǎn)化步驟如下：血清樣品用裂解液LB充分裂解后加入氯仿，混勻后12 000 r/min離心，取上層水相并加入無水乙醇(混合液)，將混合液置于RNA吸附柱并離心，經(jīng)過去蛋白液及漂洗液洗滌后收集RNA。應(yīng)用NnoDrop ONE測(cè)定RNA濃度及純度。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將獲取的合格RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 60 min， 85 ℃ 5 min，用DEPC水2倍稀釋cDNA后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熒光定量PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μmol/L上、下游引物各2 μL，2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 15 s(采集熒光信號(hào))，共40個(gè)循環(huán)。lncRNA ELFN1-AS1：正向引物5′- CCT GAT GTT CTG CTT GGT TAT-3′，反向引物5′-ACA CAG CTC CTG CTC TTG-3′；18S(內(nèi)參基因)：正向引物5′-ACA GGA TTG ACA GAT TGA-3′，反向引物5′-TAT CGG AAT TAA CCA GAC A-3′。使用QuantStudio Design Software v1.4.3進(jìn)行熔解曲線分析，評(píng)測(cè)PCR產(chǎn)物的特異度。采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA ELFN1-AS1的相對(duì)表達(dá)水平，公式為ΔΔCt=結(jié)直腸癌(Ct目的-Ct內(nèi)參)-健康對(duì)照(Ct目的-Ct內(nèi)參)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以M(P25,P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)lncRNA ELFN1-AS1對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)直腸癌組與對(duì)照組血清lncRNA ELFN1-AS1檢測(cè)結(jié)果 結(jié)直腸癌組血清lncRNA ELFN1-AS1的相對(duì)表達(dá)水平[2.291(1.23,4.55)]明顯高于對(duì)照組[0.46(0.13,1.27)](Z=-5.209,P<0.001)，見圖1。

圖1 血清lncRNA ELFN1-AS1在對(duì)照組與結(jié)直腸癌組中的相對(duì)表達(dá)水平

2.2血清lncRNA ELFN1-AS1相對(duì)表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系 將血清lncRNA ELFN1-AS1相對(duì)表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清lncRNA ELFN1-AS1相對(duì)表達(dá)水平在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)及TNM分期患者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑患者之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 血清lncRNA ELFN1-AS1相對(duì)表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[M(P25,P75)]

2.3血清lncRNA ELFN1-AS1檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值 繪制ROC曲線評(píng)估lncRNA ELFN1-AS1對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能，結(jié)果表明lncRNA ELFN1-AS1的ROC曲線下面積(AUC)為0.821(95%CI：0.734～0.908)，當(dāng)最佳截?cái)嘀禐?.465時(shí)，其診斷結(jié)直腸癌的靈敏度為74.0%，特異度為82.5%，見圖2。

圖2 血清lncRNA ELFN1-AS1診斷結(jié)直腸癌的

3 討 論

近年來，lncRNA被報(bào)道參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生過程[8]。研究表明，lncRNA ELFN1-AS1不僅參與結(jié)直腸癌的發(fā)生，且在細(xì)胞遷移及腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用。LEI等[9]發(fā)現(xiàn),lncRNA ELFN1-AS1在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于鄰近癌旁正常組織，lncRNA ELFN1-AS1表達(dá)水平較高的患者生存率明顯降低。DU等[10]發(fā)現(xiàn)，lncRNA ELFN1-AS1可以海綿樣吸附miR-191-5p，從而釋放特殊AT豐富序列結(jié)合蛋白1(SATB1)的促癌作用促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。筆者前期發(fā)現(xiàn)，lncRNA ELFN1-AS1通過激活Erk及EMT信號(hào)通路，促使結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[7]。本研究結(jié)果提示，結(jié)直腸癌組血清中可穩(wěn)定表達(dá)lncRNA ELFN1-AS1，且其相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，血清中l(wèi)ncRNA ELFN1-AS1相對(duì)表達(dá)水平在不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在不同臨床TNM分期、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)患者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示lncRNA ELFN1-AS1可能成為診斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)標(biāo)志。

癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸組織(結(jié)直腸癌227例，正常對(duì)照26例)中l(wèi)ncRNA ELFN1-AS1的表達(dá)具有診斷結(jié)直腸癌的潛在價(jià)值,其診斷結(jié)直腸癌的靈敏度為87.6%，特異度為100.0%[11]。本研究結(jié)果顯示，血清lncRNA ELFN1-AS1診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.821，當(dāng)最佳截?cái)嘀等?.465時(shí)，靈敏度和特異度分別是74.0%、82.5%，進(jìn)一步表明lncRNA ELFN1-AS1對(duì)診斷結(jié)直腸癌的重要價(jià)值。鑒于血清學(xué)的取材方便、無創(chuàng)性的特點(diǎn)，血清lncRNA ELFN1-AS1在結(jié)直腸癌篩查中可能更具明顯優(yōu)勢(shì)。

lncRNA ELFN1-AS1表達(dá)水平在結(jié)直腸癌患者血清中明顯升高，其表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，有望成為結(jié)直腸癌診斷的重要指標(biāo)之一。但由于本研究樣本量較小，仍需要進(jìn)行大規(guī)模多中心臨床研究來驗(yàn)證其有效性。