李拓鍵

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康管理中心，重慶 400038

一項(xiàng)全球性的調(diào)查研究顯示，2020年胃癌的新發(fā)病患者共約103萬(wàn)例，占所有惡性腫瘤的5.7%，死于胃癌的患者共約78萬(wàn)例，占8.2%[1]。我國(guó)胃癌發(fā)病率較高，雖然新的靶向療法、免疫療法、個(gè)性化治療等策略不斷被應(yīng)用于臨床，但是胃癌的復(fù)發(fā)率和病死率仍然較高，探究胃癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制是尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)的重要手段[2]。Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白1(Gab1)是細(xì)胞的骨架蛋白，參與細(xì)胞形態(tài)的維持，并且在口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌等疾病中具有促癌作用[3-4]。PI3K/AKT通路的激活是促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的重要信號(hào)通路，并且與胃癌的復(fù)發(fā)有關(guān)[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Gab1也可以作為信號(hào)通路中的“放大器”，通過(guò)激活通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并抑制其凋亡，F(xiàn)AN等[6]的研究顯示，Gab1可能通過(guò)激活PI3K/AKT通路抑制軟骨肉瘤細(xì)胞凋亡。然而，關(guān)于Gab1在胃癌中的表達(dá)特點(diǎn)及對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不清楚。本文主要分析Gab1在胃癌中的臨床意義，并分析Gab1通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)控轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床更好地治療胃癌提供新思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 收集2015年3月至2018年3月在陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行胃癌切除術(shù)新鮮胃癌組織及癌旁正常組織(距離腫瘤組織距離>5 cm)標(biāo)本各70份。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)過(guò)術(shù)后病理學(xué)檢測(cè)確診為胃腺癌；(2)入組前未經(jīng)過(guò)化療、放療、靶向治療；(3)知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病。本研究經(jīng)過(guò)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 人胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素來(lái)自美國(guó)Thermo Fisher公司。PI3K/AKT抑制劑LY294002購(gòu)自中國(guó)Selleck公司。pCMV6-entry-Gab1重組質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)OriGene公司。Lipofectamine 2000試劑來(lái)自美國(guó)Thermo Fisher公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)來(lái)自中國(guó)Beyotime生物技術(shù)研究所。Transwell小室及配套試劑來(lái)自美國(guó)BD Biosciences公司。PCR引物由中國(guó)Genewiz公司設(shè)計(jì)和合成。Trizol試劑來(lái)自美國(guó)Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒來(lái)自瑞士Roche公司。ABI 7500 PCR檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)自美國(guó)Life technology公司。RIPA裂解緩沖液來(lái)自中國(guó)Beyotime公司。BCA蛋白測(cè)定試劑盒和ECL試劑盒來(lái)自中國(guó)Applygen公司。Gab1免疫組化染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。Gab1、GAPDH抗體和二抗來(lái)自美國(guó)Abcam公司。PVDF膜來(lái)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織中Gab1表達(dá)情況 將標(biāo)本組織經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水、透明處理后包埋至蠟塊中，冷凍后切成4 μm厚切片。將組織脫蠟并再水化。使用3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。使用蒸鍋在95 ℃下于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中對(duì)切片進(jìn)行熱誘導(dǎo)的抗原回收。在切片標(biāo)本中加入Gab1一抗(1∶50稀釋)并在室溫下孵育45 min，加入生物素標(biāo)記的IgG抗體(1∶50稀釋)孵育30 min。滴加DAB顯色5～6 min后加入蘇木紫染色20 min。脫水透明化處理、封片。使用顯微鏡觀察染色結(jié)果。通過(guò)半定量法評(píng)估：顏色深淺為0～3分，染色范圍為0～4分，二者相乘之積作為染色強(qiáng)度。并根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分的中位數(shù)，將胃癌組織分為Gab1低表達(dá)和高表達(dá)。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及Gab1干擾AGS細(xì)胞的建立 為與臨床標(biāo)本對(duì)應(yīng)，選擇胃腺癌細(xì)胞進(jìn)行研究。AGS細(xì)胞在含有10%胎牛血清、2 mmol/L-谷氨酰胺、1%青霉素(100單位/毫升)和鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。37 ℃，5% CO2，相對(duì)濕度100%。細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、Gab1組和Gab1+LY294002組。Gab1組和Gab1+LY294002組使用Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將pCMV6-entry-Gab1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入AGS細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并通過(guò)qPCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。對(duì)照組轉(zhuǎn)染等量的陰性對(duì)照質(zhì)粒?？瞻捉M不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Gab1+LY294002組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入PI3K/AKT抑制劑LY294002抑制PI3K/AKT通路，LY294002的濃度為5 μmol/L。

1.3.3qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Gab1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 通過(guò)Trizol獲得細(xì)胞中總RNA，然后檢測(cè)RNA的純度和濃度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行qPCR試驗(yàn)(在95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 60 ℃ 1 min，4 ℃保存)。GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)用于分析Gab1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。Gab1上游引物：5′-GGT GGT GAA GTG GTC TGC TC-3′；下游引物：5′-TCG GGC TTC TTG CTT TGA CA-3′。GAPDH上游引物：5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′；下游引物：5′-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G-3′。

1.3.4Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Gab1蛋白表達(dá)水平和AKT蛋白磷酸化水平 在液氮下將細(xì)胞研磨并使用RIPA裂解緩沖液裂解，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量總蛋白水平。使用SDS-PAGE分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(50 V，120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。將PDVF膜與Gab1抗體(1∶500稀釋)在4 ℃孵育過(guò)夜，然后加入1∶5 000稀釋的HRP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并在ImagePD軟件中使用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

1.3.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將2×104個(gè)細(xì)胞接種在96孔板(每孔100 μL)，在培養(yǎng)第24、48和72 h加入10 μL CCK-8試劑并在37 ℃下培養(yǎng)2 h，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(A)值。

1.3.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將各組細(xì)胞消化后分別接種在6孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，然后在37 ℃，5% CO2，相對(duì)濕度100%條件下培養(yǎng)直至90%匯合。使用200 μL的移液槍頭從上至下輕輕劃傷細(xì)胞，將劃掉的細(xì)胞洗去。在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下測(cè)量細(xì)胞劃痕距離的百分比(兩端前緣距離/初始劃痕寬度×100%)。

1.3.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將完全培養(yǎng)基加入到Transwell小室的下室，將基質(zhì)膠加入到上室。將3×104個(gè)細(xì)胞加入至上室培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后洗去未侵入下室的細(xì)胞。將細(xì)胞使用20%甲醇固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野侵入下室的細(xì)胞數(shù)目。

2 結(jié) 果

2.1Gab1在胃癌中的表達(dá)水平及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Gab1在癌旁組織中表達(dá)水平較低，染色強(qiáng)度為(1.38±0.26)，但是在胃癌組織中的表達(dá)水平較高，染色強(qiáng)度為(5.07±0.82)，并且Gab1定位于細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1。存在淋巴轉(zhuǎn)移、存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、T3+T4浸潤(rùn)深度、Ⅲ～Ⅳ期患者較無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、T1+T2浸潤(rùn)深度、Ⅰ～Ⅱ期患者Gab1高表達(dá)水平所占比例更高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

注：A、B為免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)癌旁組織和胃癌組織中Gab1的表達(dá)，C為癌旁組織和胃癌組織中Gab1免疫組化染色評(píng)分比較；與癌旁組織比較，*P<0.05。

表1 胃癌患者Gab1表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.2各組細(xì)胞中Gab1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平比較 Gab1組和Gab1+LY294002組細(xì)胞中Gab1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組和對(duì)照組(P<0.05)，且LY294002對(duì)Gab1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平影響不明顯，見(jiàn)圖2。

注：A為各組細(xì)胞中Gab1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較；B為Western blot檢測(cè)各組中Gab1蛋白表達(dá)水平；C為各組細(xì)胞中Gab1蛋白表達(dá)水平比較；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05。

2.3各組細(xì)胞活力比較 在培養(yǎng)72 h后，Gab1組的A值(0.82±0.06)明顯較對(duì)照組、空白組和Gab1+LY294002組升高(P<0.05)。LY294002會(huì)阻斷Gab1對(duì)細(xì)胞活力的促進(jìn)作用，見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05；與Gab1組比較，^P<0.05。

2.4各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較 培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組的劃痕寬度為0 h時(shí)寬度的(50.37%±0.12%)，Gab1+LY294002組為(49.24%±0.13%)，與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Gab1組的細(xì)胞劃痕距離百分比為0 h時(shí)的(26.17%±0.09%)，明顯低于空白組、對(duì)照組、Gab1+LY294002組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。Gab1組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯高于空白組、對(duì)照組、Gab1+LY294002組(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：A為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力；B為各組細(xì)胞遷移能力比較；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05；與Gab1組比較，^P<0.05。

注：A為Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力；B為各組細(xì)胞的侵襲能力比較；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05；與Gab1組比較，^P<0.05。

2.5各組細(xì)胞AKT蛋白磷酸化水平比較 Gab1組AKT蛋白磷酸化水平明顯高于空白組、對(duì)照組和Gab1+LY294002組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

注：p-AKT為磷酸化AKT蛋白；A為Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中AKT和p-AKT蛋白水平；B為各組細(xì)胞中p-AKT/AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05；與Gab1+LY294002組組比較，^P<0.05。

3 討 論

胃癌是最常見(jiàn)的癌癥之一，在中國(guó)、日本、韓國(guó)等亞洲地區(qū)尤為普遍[7]。雖然最近十年胃癌發(fā)病率得到一定的控制，但是胃癌的病死率仍居高不下。手術(shù)是治療胃癌的最主要方法，但是大多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已經(jīng)處于晚期或者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，晚期胃癌患者的5年生存率不足20%[8]。腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖，強(qiáng)大的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致胃癌患者生存率低的主要原因之一，因此，探索胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中涉及的機(jī)制對(duì)發(fā)現(xiàn)胃癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)至關(guān)重要。

Gab1屬于Gab銜接子家族，參與信號(hào)的傳導(dǎo)，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Grb2在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，Grb2-DENND1A復(fù)合物會(huì)被表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞遷移[9]，且Grb2通過(guò)調(diào)節(jié)下游的通路參與胃癌的發(fā)生[10]。Gab1蛋白是與Grb2結(jié)合的蛋白，但是關(guān)于Gab1在胃癌中的表達(dá)特點(diǎn)和對(duì)胃癌細(xì)胞的調(diào)控作用尚不清楚。過(guò)往研究顯示，在橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤中Gab1的表達(dá)水平明顯升高，且高臨床分期(Ⅲ和Ⅳ期)的腫瘤中Gab1陽(yáng)性率明顯高于低臨床分期(Ⅰ和Ⅱ期)的腫瘤，提示在肉瘤中Gab1與不良的預(yù)后有關(guān)[11]。Kaplan-Meier生存分析和Cox風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果顯示，Gab1高表達(dá)的卵巢癌患者術(shù)后具有更低的生存率，Gab1的高表達(dá)與卵巢癌FIGO晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)[12]。此外，Gab1也可作為臨床預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)[13]。在本研究結(jié)果中，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)Gab1在癌旁組織中表達(dá)水平較低，而胃癌組織中Gab1在細(xì)胞質(zhì)中廣泛表達(dá)，并且進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，在更高的臨床分期、更深的浸潤(rùn)深度及存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移患者中Gab1高表達(dá)水平患者所占比例更高，這提示在胃癌中Gab1可能參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并且可能成為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的標(biāo)志物，但是關(guān)于Gab1與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行長(zhǎng)期的隨訪研究。

Gab1通過(guò)與Grb2蛋白結(jié)合參與信號(hào)的傳導(dǎo)，Gab蛋白與Grb2結(jié)合后，會(huì)募集PI3K/AKT等蛋白，PI3K/AKT會(huì)通過(guò)Gab1中的磷酸酪氨酸基序與Gab1相互作用，從而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的傳導(dǎo)[14-15]。而PI3K/AKT是胃癌發(fā)生和發(fā)展中的重要通路，研究顯示PI3K/AKT通路的激活會(huì)促進(jìn)一些原癌基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度增殖并且具有高轉(zhuǎn)移性[16]。因此本研究進(jìn)一步分析了過(guò)表達(dá)Gab1對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響，以及Gab1是否通過(guò)PI3K/AKT通路發(fā)揮促癌作用。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染 pCMV6-entry-Gab1重組質(zhì)粒以過(guò)表達(dá)Gab1，通過(guò)qPCR和Western blot驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染后Gab1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平明顯升高。進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，Gab1過(guò)表達(dá)時(shí)，胃癌AGS細(xì)胞的細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力明顯升高，而PI3K/AKT抑制劑LY294002會(huì)阻斷Gab1對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。既往有研究發(fā)現(xiàn)，提高Gab1的表達(dá)水平會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[17]。也有體外研究顯示，抑制Gab1表達(dá)水平具有抑制肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用[18]。本研究結(jié)果還顯示，過(guò)表達(dá)Gab1后會(huì)促進(jìn)PI3K蛋白下游蛋白AKT的磷酸化，并且使用LY294002抑制PI3K/AKT后會(huì)阻斷Gab1對(duì)AKT磷酸化的促進(jìn)作用。ZHANG等[19]研究顯示，Gab1會(huì)通過(guò)影響PI3K/AKT通路抑制bFGF誘導(dǎo)的生物學(xué)活性。本研究結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞AGS中表達(dá)上調(diào)的Gab1可能通過(guò)激活PI3K/AKT通路促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。但是關(guān)于Gab1通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，Gab1在胃癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)水平的Gab1與胃癌的惡性表型有關(guān)。上調(diào)的Gab1表達(dá)會(huì)通過(guò)激活PI3K/AKT通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲。這提示Gab1可能成為診斷和治療胃癌的新靶點(diǎn)，關(guān)于Gab1調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。