劉俞谷，賀 瑩，傅俊方，龍 軍，熊 君，江凌曉，王艷芳△

1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部微生物組醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州 510282；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院廣東省公共衛(wèi)生創(chuàng)新平臺(tái)，廣東廣州 510282

馬爾尼菲籃狀菌(TM)是一種雙相真菌，流行于東南亞地區(qū)及我國(guó)南方地區(qū)，可致播散性感染，多發(fā)于免疫缺陷患者，其病情兇險(xiǎn)、預(yù)后差，因此早期準(zhǔn)確鑒定尤為重要[1-3]。目前，TM的鑒定以其典型菌落特征(溫度雙相性和紅色素)為主，但對(duì)于形態(tài)不典型菌株，單一溫度培養(yǎng)時(shí)檢驗(yàn)人員易出現(xiàn)判斷錯(cuò)誤的情況，從而延誤患者的診治。分子生物學(xué)方法雖是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但目前尚不適用于臨床檢驗(yàn)科的常規(guī)鑒定。近年來(lái)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)在微生物鑒定領(lǐng)域發(fā)展迅速，因其具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)被稱為最有前景的鑒定方法[4-5]。目前MALDI-TOF MS應(yīng)用較廣泛的有Bruker Biotyper及VITEK MS系統(tǒng)，但其對(duì)于雙相真菌的應(yīng)用研究較為滯后[6]。本研究擬在VITEK MS科研模式(RUO模式)中構(gòu)建TM的參考數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過(guò)比較不同培養(yǎng)條件及樣品前處理方法，探索用于TM質(zhì)譜鑒定的最佳培養(yǎng)條件和前處理方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)科分離的TM 8株，菌株編號(hào)分別為ZJ01、ZJ02、ZJ2360、ZJ399、ZJ18919110、ZJ110307、ZD180201、ZJLin，以上菌株均經(jīng)形態(tài)學(xué)及ITS測(cè)序鑒定。以大腸埃希菌ATCC8739作為校準(zhǔn)和內(nèi)質(zhì)控菌株。

1.2儀器與試劑 MALDI-TOF MS儀(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司，數(shù)據(jù)庫(kù)版本V3.0，RUO模式)；隔水式電熱恒溫箱(28、35 ℃)，高速冰凍離心機(jī)，大型落地?fù)u床(美國(guó)Themo Fisher科技有限公司)；電子天平；沙保弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，廣州市迪景微生物科技公司)；VITEK MS-CHCA基質(zhì)液(主要成分為α-氰基-4羥基肉桂酸)、VITEK MS-FA(主要成分為甲酸，酵母菌前處理液)、VITEK MS-DS靶板(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司)；葡萄糖，蛋白胨[生工生物工程(上海)股份有限公司]；70%乙醇，甲酸，乙腈(天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司)，蒸餾水等。

1.3方法

1.3.1分生孢子懸液制備 于SDA平板接種上述8株TM，28 ℃培養(yǎng)5 d，用含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液收集菌液，并經(jīng)12層無(wú)菌紗布過(guò)濾得到孢子懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)孢子濃度為2×107個(gè)/毫升。

1.3.2菌株培養(yǎng) 取上述TM菌株約2×106個(gè)孢子接種于SDA、沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(SDB)中，于28、35 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，分別在第3、5、7、9天取菌落前處理進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。以編號(hào)ZD180201菌株的質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立TM質(zhì)譜參考庫(kù)。其余7株TM用于驗(yàn)證參考庫(kù)及構(gòu)建TM超級(jí)譜圖庫(kù)。

1.3.3菌落前處理方法 酵母相菌落(35 ℃)分別采用甲酸乙腈法或者直涂法處理，菌絲相菌落(28 ℃)生長(zhǎng)過(guò)程的孢子與菌絲不夠豐富，且部分生長(zhǎng)呈現(xiàn)“咬瓊脂”現(xiàn)象，難取樣，因此未采用直涂法，按照VITEK MS推薦的絲狀真菌前處理方法即甲酸乙腈法處理，具體步驟如下。甲酸乙腈法：按照VITEK MS絲狀真菌前處理方法進(jìn)行處理，即生物安全柜內(nèi)挑SDA或SDB中菌落分別于900 μL 70%乙醇靜置10 min，14 000 r/min離心2 min，棄上清液；沉淀中加入70%甲酸和乙腈各40 μL振蕩混勻，14 000 r/min離心2 min。取1 μL上清液及質(zhì)控菌株加于靶板點(diǎn)位上，干燥后覆蓋1 μL CHCA基質(zhì)液，室溫下干燥上機(jī)，自動(dòng)采集質(zhì)譜譜圖。直涂法：生物安全柜內(nèi)直接取酵母相菌落適量涂靶板，待干后加入0.5 μL VITEK MS-FA，干燥后覆蓋1 μL CHCA基質(zhì)液，同上采集質(zhì)譜譜圖。

1.3.4構(gòu)建參考庫(kù) 以其中1株(編號(hào)ZD180201)在不同培養(yǎng)基(SDA、SDB)，培養(yǎng)溫度(28、35 ℃)，培養(yǎng)天數(shù)(3、5、7、9 d)，前處理方法(甲酸乙腈法、直涂法)的高質(zhì)量譜圖，即背景噪音低、基峰分辨率高、主次峰分布錯(cuò)落有致、一致性好、主峰信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)、基線穩(wěn)定及出峰數(shù)為80～250個(gè)的譜圖，構(gòu)建TM參考庫(kù)，加入VITEK SARAMI數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.3.5結(jié)果判讀 專用分析軟件對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行判讀，版本為V3.0。靶板點(diǎn)位通過(guò)點(diǎn)位顏色變化來(lái)提示結(jié)果的可信度，通常有綠、黃、紅3種顏色。綠色提示只有一個(gè)鑒定結(jié)果，概率為60.0%～99.9%，結(jié)果可信度水平高。黃色提示儀器對(duì)標(biāo)本分辨率較低，需要進(jìn)一步采用試驗(yàn)進(jìn)行區(qū)別。紅色提示與數(shù)據(jù)庫(kù)中任何質(zhì)譜不匹配。

1.3.6驗(yàn)證并創(chuàng)建超級(jí)譜圖庫(kù) 利用其余7株TM驗(yàn)證TM參考庫(kù)，并匯總高質(zhì)量質(zhì)譜譜圖，創(chuàng)建超級(jí)譜圖庫(kù)，保留39～41個(gè)特征性峰，特征性峰權(quán)重之和≤1 400。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較不同培養(yǎng)天數(shù)、培養(yǎng)溫度、前處理方法時(shí)的TM質(zhì)譜鑒定正確率。正確率=正確鑒定菌株數(shù)/總數(shù)×100%。因樣本量小，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1不同培養(yǎng)天數(shù)、培養(yǎng)溫度及前處理?xiàng)l件對(duì)TM質(zhì)譜譜圖的影響 TM質(zhì)譜譜圖的離子峰以位于質(zhì)荷比m/z7 848.00、6 113.00、6 668.00、3 335.00附近的特征峰為主，見(jiàn)圖1。不同培養(yǎng)溫度時(shí)，特征峰信號(hào)基本相似但略有不同，28 ℃培養(yǎng)特征峰主要以m/z6 113.00附近為主峰，見(jiàn)圖1A、B，而35 ℃培養(yǎng)以m/z7 848.00附近為主峰，見(jiàn)圖1C、D。

注：A為28 ℃，SDA培養(yǎng)3 d，甲酸乙腈法；B為28 ℃，SDB培養(yǎng)3 d，甲酸乙腈法；C為35 ℃，SDA培養(yǎng)5 d，直涂法；D為35 ℃，SDA培養(yǎng)5 d，甲酸乙腈法；E為28 ℃，SDA培養(yǎng)9 d，甲酸乙腈法；F為35 ℃，SDA培養(yǎng)9 d，直涂法。

相比于SDB，SDA培養(yǎng)的TM更易采集到較多的特征離子峰信號(hào)且強(qiáng)度明顯的高質(zhì)量質(zhì)譜譜圖，見(jiàn)圖1A、B。TM在SDB 35 ℃培養(yǎng)的菌落采集的高質(zhì)量譜圖數(shù)量較少，譜圖主要表現(xiàn)為干擾峰多，特征峰信號(hào)強(qiáng)度不明顯，未納入?yún)⒖紟?kù)。且未使用SDB繼續(xù)對(duì)其他7株臨床分離菌株進(jìn)行培養(yǎng)。

不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)特征峰的數(shù)量與強(qiáng)度影響較為明顯，培養(yǎng)3～5 d時(shí)采集的質(zhì)譜譜圖質(zhì)量更佳，可獲得較多數(shù)量且信號(hào)強(qiáng)度明顯的特征峰，信噪比較高，見(jiàn)圖1A、B、C、D，而培養(yǎng)第9天時(shí)特征峰的數(shù)量明顯減少且信號(hào)強(qiáng)度減弱，甚至消失，見(jiàn)圖1E、F。

甲酸乙腈法與直涂法前處理方法進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，在特征峰最佳的第3天培養(yǎng)時(shí)，甲酸乙腈法較直涂法可獲得更多數(shù)量、信號(hào)強(qiáng)度更明顯的特征峰，且信噪比更高，質(zhì)譜譜圖與參考庫(kù)中的特征性質(zhì)譜譜圖匹配效果更好，提示蛋白提取效果更佳，見(jiàn)圖1C、D。

2.2MALDI-TOF MS對(duì)不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數(shù)的TM的鑒定正確率比較 不同培養(yǎng)溫度下的TM鑒定結(jié)果顯示，在相同培養(yǎng)天數(shù)時(shí)，35 ℃培養(yǎng)菌落鑒定正確率均高于28 ℃培養(yǎng)菌落，其中35 ℃培養(yǎng)3～7 d內(nèi)鑒定正確率均超過(guò)70.0%，培養(yǎng)5 d時(shí)鑒定正確率可達(dá)100.0%。而28 ℃培養(yǎng)菌落則需要在培養(yǎng)3～5 d內(nèi)行MALDI-TOF MS鑒定，正確率可超過(guò)70.0%,見(jiàn)表1。

表1 VITEK MS RUO模式對(duì)不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數(shù)的TM鑒定正確率比較[n/n(%)]

不同培養(yǎng)天數(shù)下的TM鑒定結(jié)果顯示，培養(yǎng)第5天鑒定正確率最高(28 ℃培養(yǎng)時(shí)鑒定正確率為85.7%，35 ℃培養(yǎng)時(shí)鑒定正確率為100.0%)，而培養(yǎng)第9天時(shí)鑒定正確率最低，均不足50.0%，見(jiàn)表1。

2.3MALDI-TOF MS對(duì)不同前處理方法培養(yǎng)的TM的鑒定正確率比較 利用甲酸乙腈法、直涂法對(duì)35 ℃，SDA培養(yǎng)的TM進(jìn)行前處理，結(jié)果顯示，經(jīng)甲酸乙腈法提取蛋白進(jìn)行鑒定的正確率略高于直涂法，見(jiàn)表2。另外，甲酸乙腈法及直涂法對(duì)TM的鑒定效果均表現(xiàn)為培養(yǎng)第3～5天鑒定正確率最高，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，鑒定正確率降低，見(jiàn)表2。

表2 VITEK MS RUO對(duì)不同前處理方法的TM的鑒定正確率比較[n/n(%)]

2.4MALDI-TOF MS在不典型TM鑒定中的價(jià)值

2.4.1不典型TM的形態(tài)學(xué)特征 本研究中的不典型TM菌株分離自南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院患者肺泡灌洗液和痰液，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為溫度雙相型，但是紅色素產(chǎn)生極緩慢，28 ℃培養(yǎng)7～9 d局部開(kāi)始分泌紅色素，經(jīng)ITS測(cè)序證實(shí)為T(mén)M(100%)，見(jiàn)圖2。

注：A為28 ℃,B為35 ℃。

2.4.2TM自建數(shù)據(jù)庫(kù)在不典型菌株鑒定中的應(yīng)用 對(duì)于28 ℃培養(yǎng)7 d未分泌紅色素的不典型TM菌株(編號(hào)ZJLin)，生長(zhǎng)速度較典型TM慢，但培養(yǎng)3～5 d時(shí)可被TM自建數(shù)據(jù)庫(kù)正確鑒定，而培養(yǎng)第7～9天均無(wú)法經(jīng)TM自建數(shù)據(jù)庫(kù)正確鑒定。不同溫度和前處理方法對(duì)鑒定結(jié)果均無(wú)差異。見(jiàn)表3。

表3 VITEK MS RUO模式TM自建數(shù)據(jù)庫(kù)在不典型TM鑒定中的應(yīng)用

3 討 論

近年來(lái)，隨著免疫抑制人群數(shù)量的增加，TM感染發(fā)病率也隨之上升。目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)TM的鑒定，主要依賴其溫度雙相的菌落特征(35 ℃培養(yǎng)為酵母樣，28 ℃培養(yǎng)為霉菌樣)及典型紅色素來(lái)判斷，但形態(tài)學(xué)鑒定主要依賴于檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)。分子生物學(xué)鑒定則需要獲取足夠數(shù)量的菌體。對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的菌落，其鑒定耗時(shí)長(zhǎng)。這限制了TM感染的早期診斷和及時(shí)治療。同時(shí)，形態(tài)不典型菌株的出現(xiàn)，向微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)TM的快速準(zhǔn)確鑒定提出挑戰(zhàn)。

MALDI-TOF MS是微生物鑒定領(lǐng)域的一項(xiàng)極具前景的新技術(shù)，有成本低、耗時(shí)短、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)菌株的快速鑒定，目前在國(guó)內(nèi)檢驗(yàn)科被廣泛推廣。但國(guó)內(nèi)外常用的Bruke Biotyper及VITEK MS系統(tǒng)均無(wú)TM鑒定參考庫(kù)，且適合用于TM質(zhì)譜鑒定的菌落培養(yǎng)條件及前處理方案鮮有報(bào)道。

質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性受許多因素影響，如培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間、蛋白提取方法等[7]。本研究比較了兩種溫度(28、35 ℃)、兩種培養(yǎng)基(SDA、SDB)培養(yǎng)3～9 d的質(zhì)譜鑒定正確率。其中從SDB 35 ℃培養(yǎng)菌落采集的質(zhì)譜譜圖數(shù)量少，干擾峰較多且特征峰信號(hào)強(qiáng)度不明顯，考慮為液體培養(yǎng)基搖菌時(shí)菌量不足及洗滌不充分所致。因此，操作時(shí)應(yīng)盡可能將菌落沉淀洗滌干凈。另外，從28 ℃ SDA及SDB中培養(yǎng)菌落采集到的質(zhì)譜譜圖無(wú)明顯差異。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)操作較復(fù)雜，培養(yǎng)液等營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)干擾質(zhì)譜分析，且菌落培養(yǎng)耗時(shí)更長(zhǎng)，因此固體培養(yǎng)基更適合臨床微生物室的快速鑒定。LAU等[8]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)后，MALDI-TOF MS能準(zhǔn)確鑒定TM，其菌絲相和酵母相質(zhì)譜譜圖類(lèi)似。本研究發(fā)現(xiàn)TM菌絲相及酵母相的特征峰相似，且與文獻(xiàn)報(bào)道的主峰一致，但在35 ℃培養(yǎng)時(shí)鑒定正確率略高。

不同真菌培養(yǎng)時(shí)間下質(zhì)譜譜圖的特征峰數(shù)量和強(qiáng)度存在明顯差異[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，TM培養(yǎng)3～5 d時(shí)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的正確率高，且第5天最佳，可達(dá)100.0%。這主要與此時(shí)質(zhì)譜譜圖質(zhì)量佳、信噪比高及鑒定結(jié)果穩(wěn)定有關(guān)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，特征峰信號(hào)強(qiáng)度減弱，甚至消失，從而出現(xiàn)錯(cuò)誤鑒定或無(wú)鑒定結(jié)果，這可能與真菌細(xì)胞壁較厚且堅(jiān)韌難破壁、色素產(chǎn)生干擾等有關(guān)。

TM于28 ℃時(shí)呈菌絲相，35 ℃呈酵母相生長(zhǎng)。法國(guó)梅里埃公司推薦對(duì)絲狀真菌采取甲酸乙腈法，對(duì)酵母菌采用直涂法進(jìn)行前處理。直涂法用于酵母菌鑒定效果好，且適用于多種商業(yè)化MALDI-TOF MS系統(tǒng)[12-15]。而甲酸乙腈法是利用甲酸及乙腈對(duì)菌體進(jìn)行蛋白提取來(lái)獲得高質(zhì)量質(zhì)譜譜圖，不僅適用于酵母菌鑒定[16]，也適用于曲霉、皮膚癬菌等絲狀真菌鑒定[17-20]。本研究比較兩種前處理方法對(duì)TM酵母相菌落的鑒定發(fā)現(xiàn)，對(duì)培養(yǎng)3～5 d的菌落，甲酸乙腈法的鑒定正確率略優(yōu)于直涂法(100.0%、100.0%vs.71.4%、85.7%)。這與甲酸乙腈法蛋白提取更充分有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)SDA培養(yǎng)3～5 d的酵母相(35 ℃)菌落，經(jīng)甲酸乙腈法處理后，可獲得良好的質(zhì)譜譜圖，鑒定正確率高。此條件也同樣適用于形態(tài)不典型的TM，為T(mén)M的快速、準(zhǔn)確鑒定提供了輔助手段。但本研究?jī)H納入8株TM的質(zhì)譜譜圖，還需要更多菌株進(jìn)一步完善數(shù)據(jù)庫(kù)并驗(yàn)證。MALDI-TOF MS提高了真菌鑒定的準(zhǔn)確性，但在鑒定中仍需努力解決如生物安全問(wèn)題、少見(jiàn)菌株數(shù)據(jù)庫(kù)問(wèn)題及樣本處理標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題。