梁 倩， 李詠富， 何揚(yáng)波， 龍明秀， 田竹希， 石 彬

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽 550006)

由于中藥材植物生長的特性，常含有大量的有機(jī)質(zhì)，容易受到微生物的污染[1]，需要進(jìn)行滅菌處理，常用方法有化學(xué)熏蒸滅菌、干熱濕熱滅菌、水洗除菌及輻照滅菌[2]，但均存在一定的局限性，對中藥材中易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定成分影響較大，而且會對環(huán)境造成一定的污染[3-4]。2015 年版《中國藥典》規(guī)定，輻照滅菌技術(shù)為原料藥滅菌方法之一，它是指將物品置于適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發(fā)生的電子束中進(jìn)行電離輻射而達(dá)到殺滅微生物的方法，具有穿透力強(qiáng)、無化學(xué)殘留、處理成本低、能耗少等優(yōu)點[5-6]，適用于含有熱敏性成分、含糖成分高、易霉變的中藥材的滅菌[7-8]。

目前，中藥材輻照滅菌存在以下問題：企業(yè)在生產(chǎn)加工中藥材過程中衛(wèi)生要求達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致中藥材細(xì)菌數(shù)量嚴(yán)重超標(biāo)，或者省去中藥材原材料的滅菌過程，對其進(jìn)行加工成制劑后利用高劑量輻照對其進(jìn)行處理，導(dǎo)致輻照劑量超過國家標(biāo)準(zhǔn)；中藥材輻照滅菌的效果不一，部分微生物例(如革蘭氏陽性微生物)很難殺死，大多數(shù)藥廠會因其不達(dá)標(biāo)而進(jìn)行重復(fù)輻照。中藥材輻照滅菌技術(shù)得到推廣應(yīng)用的同時，其安全性問題也成為了關(guān)注點之一[9-10]。

常用于鑒定輻照物品和食品的檢測方法有光釋光法、熱釋光法、電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)波譜法等[11-12]，但目前對ESR波譜法的應(yīng)用相對較少，它可以靈敏地檢測出自由基的產(chǎn)生[13-14]，其原理是樣品通過輻照產(chǎn)生的自由基被樣品中的骨頭、纖維素等固體或干硬物捕獲，從而被檢測出來，具有靈敏、便捷、對樣品無損傷等優(yōu)點，已成功應(yīng)用在干果[15-16]、植物[17-18]、肉類[19-20]、醫(yī)療器械[21]檢測中，但鮮有涉及中藥材。本實驗對輻照杜仲、金銀花、黑骨藤ESR信號強(qiáng)度與吸收劑量之間關(guān)系等進(jìn)行研究，為中藥材輻照質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 微型電子自旋共振(ESR)波譜儀，德國Bruker公司；CX-100型高速多功能粉碎機(jī)，上海緣沃工貿(mào)有限公司；40目標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；60Co-γ輻射源，貴州省金農(nóng)輻照技術(shù)有限公司。

1.2 藥材 杜仲、金銀花、黑骨藤購于貴州省貴陽市中藥材市場，經(jīng)專家鑒定為正品，自然晾干后用粉碎機(jī)將其粉碎，過40目篩，聚乙烯自封袋包裝，備用。

1.3 方法

1.3.160Co-γ射線輻照 稱取3種藥材各10 g，裝入7組聚乙烯自封包裝袋中，每種6組，設(shè)置吸收劑量為1、3、5、7、9、12 kGy，對其進(jìn)行60Co-γ射線輻照，室溫保存。采用重鉻酸銀劑量計標(biāo)定，劑量計與中國計量科學(xué)院劑量計(NDAS)對比，要求誤差小于±3%。

1.3.2 ESR檢測 準(zhǔn)確稱取輻照后樣品適量，裝入ESR管中，壓實，置于諧振腔中，每個樣品平行3份，重復(fù)測量3次。工作條件為中心磁場3 460 Gs；掃描寬度100 Gs；微波功率15～40 mW；調(diào)制振幅5.3 Gs；溫度室溫。

2 結(jié)果

2.1 ESR對杜仲60Co-γ射線輻照后的影響

2.1.1 信號強(qiáng)度與微波功率的關(guān)系 圖1顯示，吸收劑量7 kGy、微波功率0.5～15 mW時波譜峰信號強(qiáng)度為1.2～13.47，信號強(qiáng)度越大，波譜峰振幅越明顯，故選擇15 mW。

圖1 微波功率對杜仲60Co-γ射線輻照后信號強(qiáng)度的影響

2.1.2 波譜信號 輻照處理后，植物中重點纖維素和多糖在60Co-γ射線作用下能誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基，含有未成對電子，在外加磁場的作用下會產(chǎn)生自旋共振吸收現(xiàn)象[22]。不同劑量輻照后杜仲粉ESR波譜圖(0～12 kGy)見圖2，可知在0 kGy時在中心磁場出現(xiàn)1個特征峰，其中波譜特征參數(shù)g=2.006 8±0.001 9，正負(fù)峰高之間磁場寬度ΔH=49.32 Gs；經(jīng)過0～12 kGy劑量輻照后，在中心磁場區(qū)域出現(xiàn)的波譜峰信號強(qiáng)度均增大，在12 kGy時更明顯。

2.1.3 信號強(qiáng)度與吸收劑量的關(guān)系 杜仲吸收劑量與ESR波譜信號強(qiáng)度呈正相關(guān)，二次擬合式為Y=-0.006 5X2+1.207 1X+6.778 7(r=0.984 3)，在0～12 kGy范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 不同劑量60Co-γ射線輻照后杜仲ESR波譜圖

2.1.4 信號強(qiáng)度與貯藏時間的關(guān)系 貯藏時間是影響ESR強(qiáng)度變化的重要因素[23]，本實驗在相同貯藏條件下，檢測0～80 d內(nèi)各藥材60Co-γ射線輻照后ESR信號強(qiáng)度，結(jié)果見表1。由此可知，在20 d時吸收劑量1 kGy的ESR信號強(qiáng)度衰變了44%，3～9 kGy衰變了60%左右，12 kGy衰變了80%；在20～80 d時，衰變趨勢變平緩；在80 d時，所有吸收劑量的ESR信號強(qiáng)度衰變平均超過70%，其中12 kGy衰變了90%，表明杜仲最佳檢測時間在80 d內(nèi)。

表1 60Co-γ射線輻照后杜仲在不同貯藏時間的ESR信號強(qiáng)度

2.2 ESR對金銀花60Co-γ射線輻照后的影響

2.2.1 信號強(qiáng)度與微波功率的關(guān)系 圖3顯示，吸收劑量7 kGy、微波功率25 mW時波譜峰振幅較明顯，故選擇25 mW。

圖3 金銀花60Co-γ射線輻照后微波功率對信號強(qiáng)度的影響

2.2.2 波譜信號 金銀花經(jīng)1、3、5、7、9、12 kGy60Co-γ射線輻照后，ESR波譜信號強(qiáng)度見圖4。由此可知，輻照前在中心磁場出現(xiàn)1個特征峰，其中波譜特征參數(shù)g=2.006 5±0.001 0，正負(fù)峰高之間磁場寬度ΔH=41.3 Gs；輻照后中心磁場的波譜峰信號強(qiáng)度均發(fā)生改變，ESR波譜峰信號強(qiáng)度均有所增大；隨著吸收劑量增加，波譜峰信號強(qiáng)度、自由基總量升高，在特征峰兩邊出現(xiàn)較不明顯的對稱峰，這是由于纖維素輻照后產(chǎn)生的自由基特征峰[24]。

圖4 不同劑量60Co-γ射線輻照后的金銀花ESR波譜圖

2.2.3 信號強(qiáng)度與吸收劑量的關(guān)系 金銀花吸收劑量與ESR波譜信號強(qiáng)度呈正相關(guān)，二次項擬合式為Y=-0.032 4X2+1.707 8X+2.788 9(r=0.998 8)，在0～12 kGy范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 信號強(qiáng)度與貯藏時間的關(guān)系 在0～80 d內(nèi)60Co-γ射線輻照后金銀花ESR信號強(qiáng)度隨時間的變化規(guī)律見表2。由此可知，在20 d時，吸收劑量1～9 kGy的ESR信號強(qiáng)度衰變在50%～70%之間，12 kGy衰變了80%；在2～80 d時，衰變趨勢變平緩；在80 d時，所有吸收劑量的ESR信號強(qiáng)度衰變均超過60%，并且與未輻照時的信號強(qiáng)度峰值接近，表明金銀花最佳檢測時間在80 d內(nèi)。

表2 60Co-γ射線輻照后金銀花在不同貯藏時間的ESR信號強(qiáng)度

2.3 ESR對黑骨藤60Co-γ射線輻照后的影響

2.3.1 信號強(qiáng)度與微波功率的關(guān)系 圖5顯示，吸收劑量7 kGy、微波功率0.5～70 mW時，波譜信號強(qiáng)度先明顯升高在40 mW后趨于平穩(wěn)，而且微波功率過高會引起波譜峰的不穩(wěn)定，故選擇40 mW。

圖5 黑骨藤60Co-γ射線輻照后微波功率對信號強(qiáng)度的影響

2.3.2 波譜信號分析 黑骨藤經(jīng)1、3、5、7、9、12 kGy60Co-γ射線輻照后，ESR波譜信號強(qiáng)度見圖6。由此可知，輻照前ESR波譜峰出現(xiàn)在磁場中心范圍，g=2.006 4±0.001 0，磁場寬度ΔH=51.68 Gs；輻照后譜峰信號強(qiáng)度升高；黑骨藤以根莖入藥，該部位有大量纖維，而在特征峰兩旁也產(chǎn)生了具有纖維素特征的對稱峰。

圖6 不同劑量60Co-γ射線輻照后的黑骨藤ESR波譜圖

2.3.3 信號強(qiáng)度與吸收劑量關(guān)系 黑骨藤吸收劑量與ESR波譜信號強(qiáng)度呈正相關(guān)，二次項擬合式為Y=-0.201 2X2+4.083 3X+9.426 9(r=0.940 4)，在0～12 kGy范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 信號強(qiáng)度與貯藏時間關(guān)系 在0～80 d內(nèi)60Co-γ射線輻照后黑骨藤ESR信號強(qiáng)度隨時間的變化規(guī)律見表3。由此可知，在20 d時，所有吸收劑量的ESR信號強(qiáng)度在吸收劑量1、3 kGy下衰變?yōu)?0%，其余均衰變超過60%；在20～80 d時，衰變趨勢變平緩；在80 d時，ESR信號強(qiáng)度衰變值均未達(dá)到輻照前水平。再考察ESR信號強(qiáng)度與貯藏時間的關(guān)系，結(jié)果見表4，發(fā)現(xiàn)最短檢測時間為97 d，表明黑骨藤最佳檢測時間在97 d內(nèi)。

表3 60Co-γ射線輻照后黑骨藤在不同貯藏時間的ESR信號強(qiáng)度

3 討論

杜仲、金銀花、黑骨藤在射線的作用下能誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，自由基中有未成對電子，在外加磁場作用下會產(chǎn)生自旋共振吸收現(xiàn)象，ESR檢測后信號強(qiáng)度反映了共振條件下樣品吸收的總能量，自由基含量越大，信號強(qiáng)度越大[25]。輻照后，3種中藥材ESR波譜峰振幅強(qiáng)度均發(fā)生改變，并且與未輻照的波譜峰振幅強(qiáng)度相比均有所增大，說明輻照產(chǎn)生的自由基含量隨著吸收劑量增加而增加，與輻照樹豆莢[26]一致。吸收劑量與波譜信號之間呈正相關(guān)，在輻照范圍內(nèi)相關(guān)性均良好(r≥0.95)，與輻照中藥顆粒[27]一致，說明用ESR可以檢測輻照中藥材。李偉明[28]等發(fā)現(xiàn)，在15 d內(nèi)葡萄皮ESR信號強(qiáng)度衰減為80%，葡萄籽和葡萄柄衰減為50%。貯藏時間直接影響了輻照后信號強(qiáng)度的衰變[29]，在80 d內(nèi)杜仲與金銀花藥材的輻照信號強(qiáng)度衰變值與未輻照的信號強(qiáng)度值接近，因此≤80 d內(nèi)對輻照杜仲、金銀花的檢測較為準(zhǔn)確；通過線性擬合得出，黑骨藤最佳檢測時間為≤97 d。另外，微波功率對波譜信號強(qiáng)度有一定的影響，這與前期報道一致[30]。

表4 黑骨藤信號強(qiáng)度與貯藏時間的擬合結(jié)果

4 結(jié)論

本實驗探索杜仲、金銀花、黑骨藤輻照后ESR信號強(qiáng)度與微波功率、吸收劑量、貯藏時間之間的關(guān)系，證明誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基與波譜峰信號強(qiáng)度之間呈正相關(guān)，微波功率對波譜信號有一定的影響；吸收劑量與波譜信號之間呈正相關(guān)，在輻照范圍內(nèi)相關(guān)性良好(r≥0.95)；貯藏時間對波譜信號有一定的影響。因此，建議在80 d內(nèi)對輻照杜仲、金銀花，97 d內(nèi)對輻照黑骨藤進(jìn)行鑒定。