華伊，張正一，王艷艷，黃莉莉，葉曉楠，李廷利

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗[ZiziphusjujubaMill.Var.spinosae(Bunge)Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟種子，主治虛煩不眠、驚悸多夢(mèng)等癥[1]，酸棗仁在臨床的應(yīng)用普遍使用炒制品?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)炒酸棗仁能減少行為學(xué)測(cè)試中動(dòng)物的焦慮樣行為，具有一定的抗焦慮作用[2-3]。腦科學(xué)領(lǐng)域普遍認(rèn)為杏仁核(amygdala)是參與調(diào)節(jié)焦慮相關(guān)的情緒、行為和生理反應(yīng)的一個(gè)重要腦區(qū)[4-5]，杏仁核的基底外側(cè)核團(tuán)(basolateral amygdala，BLA)是焦慮調(diào)節(jié)過程中接收刺激信息傳入的主要部分[6]。杏仁核功能的改變已被認(rèn)為是焦慮癥的一個(gè)潛在條件[7-8]，焦慮行為的增加與BLA區(qū)的過度活躍有關(guān)[9]。近年來，BLA區(qū)作為神經(jīng)回路中治療焦慮相關(guān)狀態(tài)和行為的關(guān)鍵成分被廣泛研究[10-12]。筆者在本文將行為學(xué)與神經(jīng)元在體同步電活動(dòng)相結(jié)合，進(jìn)行了焦慮大鼠的行為學(xué)及BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼動(dòng)態(tài)變化的研究，同時(shí)考察炒酸棗仁對(duì)其的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(220±20)g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-004。動(dòng)物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)環(huán)境為通風(fēng)、避光、隔音、電磁屏蔽狀態(tài)，并通過自動(dòng)定時(shí)光控系統(tǒng)進(jìn)行12 h/12 h明暗光照周期處理(每日7：00—19：00開啟照明，19：00至次日7：00關(guān)閉照明)；室內(nèi)溫度：20～24 ℃；相對(duì)濕度：50%～60%；噪聲≤40 dB。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠在本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境內(nèi)適應(yīng)7 d，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中所有大鼠不限制飲食和飲水。

1.2藥物與試劑 酸棗仁，原產(chǎn)地山西，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為正品，依照文獻(xiàn)[13]方法，制備炒酸棗仁和炒酸棗仁水煎液；0.9%氯化鈉溶液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170104D5)；戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：WS20140104)；義齒基托聚合物(上海貝瓊齒材有限公司，批號(hào)：170308)；義齒基托樹脂(上海新世紀(jì)齒科材料有限公司，批號(hào)：20170408)。

1.3儀器與設(shè)備 大鼠獨(dú)立通氣籠IVC(型號(hào)：RU25H5，蘇州市蘇杭科技器材有限公司)，分析天平(型號(hào)：MS105，梅特勒-托利多儀器上海有限公司，感量：0.01 mg)，大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(100 cm×100 cm×40 cm，木制)，標(biāo)準(zhǔn)腦立體定位儀(型號(hào)：51600，美國Stoelting公司)，在體多通道神經(jīng)記錄分析系統(tǒng)(型號(hào)：OPX-32D，美國Plexon公司)，在體單軸微操作儀(型號(hào)：IVM-1000，Microelettrica Scientifica China)。

1.4在體多通道記錄電極的埋植 選取SD雄性大鼠20只，進(jìn)行電極埋植手術(shù)前，所有大鼠禁食8 h，不禁水。戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后，將其固定在標(biāo)準(zhǔn)腦立體定位儀上。根據(jù)《George Paxinos & Charles Watson大鼠腦立體定位圖譜》(第3版)，定位BLA區(qū)位置(坐標(biāo)AP 2.5～2.8 mm，ML 4.5～4.8 mm，DV 7.5 mm)，將16(4×4)通道在體記錄電極(鉑銥合金，電極絲外周涂有絕緣層，直徑35 μm)埋置于大鼠的BLA區(qū)域，并用義齒基托樹脂將電極部分固定在動(dòng)物顱頂。術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)4～5 d，于有機(jī)玻璃籠內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.5動(dòng)物的分組及給藥 將已植入電極并經(jīng)過術(shù)后恢復(fù)的大鼠經(jīng)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組與炒酸棗仁組，每組10只。炒酸棗仁組每日灌胃給予大鼠炒酸棗仁水煎液(17.5 g·kg-1)，模型對(duì)照組給予同等體積純化水，每日1次，連續(xù)7 d。

1.6模型的制備及行為學(xué)測(cè)試 利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)復(fù)制大鼠焦慮模型，每日給藥0.5 h后，將各組大鼠放入曠場(chǎng)箱內(nèi)底面中心，任其自由探索，利用動(dòng)物行為學(xué)采集和分析系統(tǒng)，記錄10 min內(nèi)大鼠在曠場(chǎng)中的行為學(xué)表現(xiàn)，每日1次，連續(xù)7 d。測(cè)試指標(biāo)為跨格次數(shù)、站立次數(shù)、進(jìn)入中央格次數(shù)、中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間(s)和總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(s)，并以中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間除以總運(yùn)動(dòng)時(shí)間計(jì)算中央格/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(%)。

1.7神經(jīng)元在體放電信號(hào)的采集與處理 每日給藥0.5 h后，利用在體多通道神經(jīng)記錄分析系統(tǒng)，先采集各組大鼠在日常飼養(yǎng)環(huán)境中BLA區(qū)神經(jīng)元基礎(chǔ)放電信號(hào)(10 min)，再在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的同時(shí)采集曠場(chǎng)環(huán)境中的BLA區(qū)神經(jīng)元曠場(chǎng)放電信號(hào)(10 min)，每日1次，連續(xù)7 d。利用Offline Sorter軟件對(duì)采集到的神經(jīng)元放電信號(hào)進(jìn)行處理，過濾低頻放電和環(huán)境干擾放電，設(shè)置信噪比>3：1的信號(hào)為所需的動(dòng)作電位信號(hào)，運(yùn)用主成分分析(principal component analysis，PCA)技術(shù)對(duì)提取出的動(dòng)作電位進(jìn)行分類處理，并計(jì)算每一類神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆烹婎l率。將每只大鼠的每一類神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢辉跁鐖?chǎng)中的放電頻率減去其基礎(chǔ)放電頻率，得出的值定義為神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率增加值，以此值進(jìn)行兩組大鼠在曠場(chǎng)中神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率變化的對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1炒酸棗仁對(duì)焦慮大鼠行為學(xué)動(dòng)態(tài)變化的影響 隨著測(cè)試天數(shù)的增加，大鼠跨格次數(shù)、站立次數(shù)及總運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸下降，進(jìn)入中央格次數(shù)變化平穩(wěn)，中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中央格/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(%)逐漸上升。與模型對(duì)照組比較，炒酸棗仁組大鼠跨格次數(shù)在第5天明顯減少(P<0.05)；站立次數(shù)在第2，4，5，7天明顯減少(P<0.05或P<0.01)；總運(yùn)動(dòng)時(shí)間1～7 d均無明顯變化(P>0.05)；進(jìn)入中央格次數(shù)在第1天明顯增加(P<0.01)；中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間在第1～第3，第6天明顯增加(P<0.05或P<0.01)；中央格/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(%)在第1，第3、第5～第7天明顯增加(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

①與模型對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

2.2炒酸棗仁對(duì)焦慮大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼動(dòng)態(tài)變化的影響

2.2.1大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆诸惣疤卣鲌D 在大鼠BLA區(qū)記錄到的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊ㄐ翁卣鳛椋翰ㄩL(zhǎng)較長(zhǎng)，波峰后曲線下降緩慢。按照放電特征的不同，把在BLA區(qū)記錄到的神經(jīng)元分為Ⅰ、Ⅱ兩類(以下稱BLA區(qū)Ⅰ類神經(jīng)元為NeuronⅠ，Ⅱ類神經(jīng)元為NeuronⅡ)。NeuronⅠ的時(shí)長(zhǎng)較長(zhǎng)、振幅稍低，自相關(guān)圖中出現(xiàn)典型的尖峰、峰值后表現(xiàn)出快速的指數(shù)型下降；NeuronⅡ的時(shí)長(zhǎng)較短、振幅較高，自相關(guān)圖中峰值后下降緩慢。兩類神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹娔Ｊ降奶卣鲌D見圖2。

A.NeuronⅠ動(dòng)作電位；B.NeuronⅡ動(dòng)作電位；a.波形圖；b.放電間隔直方圖；c.自相關(guān)圖。

2.2.2焦慮大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率的動(dòng)態(tài)變化 與自身的基礎(chǔ)放電頻率相比，模型對(duì)照組和炒酸棗仁組大鼠在曠場(chǎng)中NeuronⅠ、NeuronⅡ動(dòng)作電位放電頻率在1～7 d均有所增加；NeuronⅠ、NeuronⅡ在曠場(chǎng)中動(dòng)作電位放電頻率在1～2 d均有所增加，然后在2～7 d逐漸下降。NeuronⅠ與NeuronⅡ的放電數(shù)比例約為2：1。各組放電頻率直方圖見圖3。

底部未畫黑線部分為大鼠處于日常飼養(yǎng)環(huán)境中的基礎(chǔ)放電，畫黑線部分為大鼠處于曠場(chǎng)環(huán)境中的曠場(chǎng)放電。

2.2.3炒酸棗仁對(duì)焦慮大鼠BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率動(dòng)態(tài)變化的影響 由于與自身的基礎(chǔ)放電頻率相比，每只大鼠在曠場(chǎng)中的NeuronⅠ、NeuronⅡ動(dòng)作電位放電頻率在1～7 d均有所增加，以神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率增加值進(jìn)行兩組大鼠在曠場(chǎng)中動(dòng)作電位放電頻率變化的對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型對(duì)照組比較，炒酸棗仁組大鼠BLA區(qū)NeuronⅠ的動(dòng)作電位放電頻率增加值在第1，3～6天明顯減少(P<0.05或P<0.01)，NeuronⅡ的動(dòng)作電位放電頻率增加值在第1，3，4，6，7天明顯減少((P<0.05或P<0.01)。見圖4。

①與模型對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

3 討論

嚙齒動(dòng)物面對(duì)曠場(chǎng)提供的新環(huán)境時(shí)，同時(shí)產(chǎn)生對(duì)空曠環(huán)境的恐懼和對(duì)新奇環(huán)境的探索欲[14]，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)利用這種矛盾沖突心理，在造成動(dòng)物焦慮情緒的同時(shí)，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性和焦慮水平的評(píng)估[15-16]。本文利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)制備大鼠焦慮模型，考察了連續(xù)7 d大鼠焦慮狀態(tài)下的行為學(xué)動(dòng)態(tài)變化。曠場(chǎng)行為學(xué)結(jié)果顯示，大鼠的運(yùn)動(dòng)性相關(guān)指標(biāo)，包括跨格次數(shù)、站立次數(shù)及總運(yùn)動(dòng)時(shí)間，隨著測(cè)試時(shí)間的增加均逐漸減少。這一現(xiàn)象反映，隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，大鼠對(duì)曠場(chǎng)環(huán)境逐漸適應(yīng)從而減弱它們對(duì)曠場(chǎng)的好奇心，降低大鼠的探索行為。

曠場(chǎng)環(huán)境的中央格區(qū)域?qū)?dòng)物意味著潛在威脅，周邊格相較而言更安全，動(dòng)物在中央格區(qū)域的探究行為越多，代表動(dòng)物的焦慮程度越低[17]。連續(xù)7 d的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠的焦慮相關(guān)指標(biāo)，包括中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間及中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間(%)，隨著測(cè)試時(shí)間的增加而逐漸增加，表明動(dòng)物的焦慮程度逐漸減輕。大鼠的焦慮樣行為在初次接觸曠場(chǎng)時(shí)表現(xiàn)得更為強(qiáng)烈，而焦慮水平隨著重復(fù)接觸曠場(chǎng)而逐漸降低。這些觀察結(jié)果證明，動(dòng)物在反復(fù)暴露于曠場(chǎng)環(huán)境后表現(xiàn)出習(xí)慣化行為，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致。HSIAO等[19]報(bào)道，連續(xù)進(jìn)行4 d的曠場(chǎng)測(cè)試，動(dòng)物在中心格區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間會(huì)逐漸減少，即反復(fù)接觸曠場(chǎng)后焦慮水平會(huì)增加，與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差異，可能是因?yàn)槊刻靹?dòng)物進(jìn)行50 min的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，而本文每日只測(cè)試10 min。因此，推測(cè)重復(fù)暴露于致焦慮環(huán)境中的時(shí)間過長(zhǎng)不會(huì)建立習(xí)慣化行為，反而會(huì)造成焦慮程度增加。

本實(shí)驗(yàn)在利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)制備大鼠焦慮模型的同時(shí)，記錄連續(xù)7 d大鼠BLA區(qū)在體神經(jīng)元的基礎(chǔ)放電及在曠場(chǎng)環(huán)境中曠場(chǎng)放電情況。本文采集到的BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏牟ㄐ翁卣鳛椴ㄩL(zhǎng)較長(zhǎng)，波峰后曲線下降緩慢，與文獻(xiàn)[20]報(bào)道結(jié)果一致。將在BLA區(qū)收集到的神經(jīng)元信號(hào)按動(dòng)作電位的波形和放電特征分為Ⅰ、Ⅱ兩類，與基礎(chǔ)放電頻率相比，所有大鼠的NeuronⅠ、NeuronⅡ在連續(xù)7 d的曠場(chǎng)環(huán)境中其動(dòng)作電位放電頻率均增加。這一現(xiàn)象表明，曠場(chǎng)環(huán)境改變大鼠BLA區(qū)的神經(jīng)元信息編碼，NeuronⅠ、NeuronⅡ均參與了曠場(chǎng)對(duì)動(dòng)物的焦慮加工。

通過對(duì)BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率增加值變化的觀察，發(fā)現(xiàn)NeuronⅠ、NeuronⅡ的動(dòng)作電位放電頻率在1～2 d均有所增加，然后在2～7 d持續(xù)下降。文獻(xiàn)[20]報(bào)道小鼠在連續(xù)3 d在曠場(chǎng)環(huán)境中BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率持續(xù)增加，本研究在1～2 d的結(jié)果與上述報(bào)道相似。這一現(xiàn)象提示，反復(fù)暴露于曠場(chǎng)環(huán)境中可能會(huì)引發(fā)BLA區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性的短期增強(qiáng)，提高BLA區(qū)神經(jīng)元的興奮性。本研究結(jié)果顯示從第2天開始BLA區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环烹婎l率呈下降趨勢(shì)，與WANG等[20]研究存在差異，推測(cè)造成此差異的原因與在曠場(chǎng)中的暴露時(shí)間有關(guān)。WANG等[20]研究中動(dòng)物每日進(jìn)行30 min的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，而本文每日只測(cè)試10 min，提示重復(fù)接觸致焦慮的曠場(chǎng)環(huán)境的時(shí)間過長(zhǎng)不會(huì)建立習(xí)慣化行為，反而會(huì)造成動(dòng)物焦慮水平的逐漸增加，這與行為學(xué)結(jié)果的分析相同，但仍需進(jìn)一步的研究確定。本文第2～7天的結(jié)果證明，由于測(cè)試次數(shù)的不斷增加，大鼠建立習(xí)慣性行為，逐漸減輕在曠場(chǎng)中的焦慮程度，從而降低了BLA區(qū)神經(jīng)元的放電頻率，與行為學(xué)測(cè)試的結(jié)果一致。

本研究在觀察焦慮大鼠行為學(xué)和神經(jīng)元在體活動(dòng)動(dòng)態(tài)變化的同時(shí)，給予炒酸棗仁水煎液干預(yù)，探討炒酸棗仁對(duì)其的影響作用。行為學(xué)結(jié)果顯示，炒酸棗仁減少大鼠在第5，7天的跨格次數(shù)，并減少了第2，4，5，7天的站立次數(shù)。這一現(xiàn)象表明炒酸棗仁能降低重復(fù)暴露于曠場(chǎng)環(huán)境中大鼠的運(yùn)動(dòng)性和探索行為。同時(shí)，炒酸棗仁增加大鼠第1天的進(jìn)入中央格次數(shù)，增加第1～3，6天的中央格運(yùn)動(dòng)時(shí)間，并增加了第1，3，5～7天的中央格/總運(yùn)動(dòng)時(shí)間，表明炒酸棗仁能減輕曠場(chǎng)對(duì)大鼠造成的焦慮情緒。由于重復(fù)暴露于曠場(chǎng)環(huán)境中，大鼠建立了習(xí)慣化行為，焦慮水平隨著測(cè)試次數(shù)增加而降低，然而炒酸棗仁仍然能降低重復(fù)測(cè)試中動(dòng)物的焦慮水平，提示炒酸棗仁的抗焦慮效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了動(dòng)物自身的適應(yīng)能力。

神經(jīng)元在體電活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，炒酸棗仁在第1，3～6天減少了大鼠NeuronⅠ動(dòng)作電位放電頻率增加值，在第1，3，4，6，7天減少了大鼠NeuronⅡ動(dòng)作電位放電頻率增加值。表明炒酸棗仁通過抑制BLA區(qū)神經(jīng)元的過度放電改變BLA區(qū)神經(jīng)元信息編碼，拮抗曠場(chǎng)對(duì)大鼠造成的焦慮狀態(tài)。此外，在某些測(cè)試時(shí)間，炒酸棗仁能明顯減少BLA區(qū)神經(jīng)元電活動(dòng)，但動(dòng)物的焦慮樣行為并沒有顯著變化。推測(cè)是由于炒酸棗仁的抗焦慮作用并不是由某一腦區(qū)的一類神經(jīng)元介導(dǎo)，可能是多個(gè)腦區(qū)或多類神經(jīng)元共同作用的結(jié)果，具體原因還需進(jìn)一步研究。