張海珍,楊文俊,楊正根

（廣州康盛生物科技股份有限公司，廣東 廣州，510660）

金黃色葡萄球菌蛋白A 能與人類及多種哺乳動(dòng)物血清中免疫球蛋白分子的Fc 段特異性結(jié)合，在抗體純化用親和層析介質(zhì)［1,2］及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用［1］。為防止蛋白A 溶液在冷藏或常溫儲(chǔ)存過(guò)程中可能發(fā)生的微生物污染、延長(zhǎng)保存時(shí)間，需要在保存液中加入抑菌劑。聚已亞甲基鹽酸（PHMB）是目前公認(rèn)的較安全的抑菌劑［3］，對(duì)細(xì)菌和真菌的殺滅效果均較好［4-5］,被廣泛用于新型抑菌材料的研發(fā)［6-8］。本文對(duì)PHMB 不同濃度及不同時(shí)間處理后，重組蛋白A 溶液中的菌數(shù)下降情況進(jìn)行比較研究，以期為同類重組蛋白制品中抑菌劑的選擇提供參考。

一、材料與方法

（一）材料與儀器

大 腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44102〕、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26003〕、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10104〕、白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98001〕及黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC（F）98003〕均為購(gòu)買自中國(guó)藥品生物制品檢定所的標(biāo)準(zhǔn)菌株，菌數(shù)傳代為第二代。胰蛋白胨大豆肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖（瓊脂）培養(yǎng)基、氯化鈉-蛋白胨緩沖液為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。PHMB（20%）購(gòu)自廣州市拓瑞化工科技有限公司；BCA 試劑盒購(gòu)自Thermo 公司；瓊脂糖購(gòu)自GE公司；高碘酸鈉購(gòu)自天津福晨化學(xué)試劑廠；重組蛋白A 溶液、人IgG 溶液、PBS 溶液、洗脫溶液由本實(shí)驗(yàn)室制備。

實(shí)驗(yàn)儀器有ZQWY-200N 型臥式恒溫振蕩器（上海知楚儀器有限公司）、UV-2600 型紫外分光光度計(jì)（日本島津）和LRHS-205F-11 恒濕恒溫培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.菌液的制備

將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌甘油菌接種至20 ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，然后用0.9 %無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成108cfu/ml 的菌懸液。白色念珠菌甘油菌接種至20 ml 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，然后用0.9 %無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成108cfu/ml 的菌懸液。黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，然后用含0.05 %聚山梨酯80 的0.9 %無(wú)菌氯化鈉溶液將表面的孢子洗脫，制成108cfu/ml 的孢子懸液。各菌株的菌懸液同時(shí)用平皿法作活菌計(jì)數(shù)。

2.供試液的制備

取廣州康盛生物科技有限公司生產(chǎn)的無(wú)菌無(wú)熱原的重組蛋白A 溶液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至終濃度約5 mg/ml，分裝至儲(chǔ)液瓶中，然后加入PHMB溶液。

3.計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

采用培養(yǎng)基稀釋法消除供試液的抑菌活性。分別加入相應(yīng)溶液于無(wú)菌平皿后，立即傾入溫度不超過(guò) 45 ℃的瓊脂培養(yǎng)基，混勻凝固，倒置培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。細(xì)菌使用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)24 h；真菌使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,其中白色念珠菌25 ℃培養(yǎng)48 h，黑曲霉25 ℃培養(yǎng)5～7d。

（1）試驗(yàn)組：取制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使供試液中含菌量不大于100 cfu/ml。

（2）供試品對(duì)照組：取制備好的供試液，以生理鹽水代替菌液同試驗(yàn)組操作。

（3）菌液對(duì)照組：以生理鹽水替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值應(yīng)不小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)值的50%。

4.抑菌效力測(cè)定

將含PHMB 的供試液分裝于無(wú)菌儲(chǔ)液瓶中，每瓶100ml，按接菌量105～106cfu 接入各個(gè)菌株的菌懸液或孢子懸液。充分搖勻后，從三角瓶中取出1 ml，用氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋10-3～10-5后倒平板，得到0 時(shí)溶液中的初始菌落數(shù)。然后放置不同時(shí)間后分別從三角瓶中取樣1ml，采取平皿法計(jì)數(shù)。其中，每個(gè)稀釋度2 個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均菌落數(shù)。2020版中國(guó)藥典［9］規(guī)定抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1，應(yīng)符合A 的抑菌效力。

表1 抑菌效力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)

5.重組蛋白A 溶液穩(wěn)定性測(cè)定

在重組蛋白A 溶液中加入PHMB，使其終濃度為0.15%（1.5 g/L），常溫放置（10～30 ℃）12 個(gè)月，分別在0、3、6、9、12 個(gè)月取出部分樣品，測(cè)定蛋白濃度及蛋白活性以考察蛋白的穩(wěn)定性。其中，蛋白濃度用BCA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定。蛋白活性的測(cè)定是將重組蛋白A 偶聯(lián)至瓊脂糖Sepharose 6FF 上，評(píng)價(jià)免疫吸附材料的吸附性能。

吸附劑的合成：取5 ml 瓊脂糖凝膠用50 ml 純化水清洗后與20 ml 濃度為0.05 mol/L 的高碘酸鈉溶液混合置于三角瓶中，30 ℃，150 rpm避光反應(yīng)3 h，用50 ml 的純化水洗滌；然后加入10 ml 的重組蛋白A 溶液（pH 8.4 的硼酸鹽緩沖液），30 ℃，150 rpm 避光反應(yīng)4 h，用50 ml的純化水清洗；加入10 ml pH 7.6的磷酸鹽緩沖液及2.5 ml 乙醇胺溶液進(jìn)行封端，于30 ℃、150 rpm 避光反應(yīng)1 h；最后分3 次加入0.1 g的硼氫化鈉還原12 h；用50 ml 的純化水清洗即可。

吸附性能的測(cè)定采用靜態(tài)吸附法：取合成的吸附劑1 ml 于一次性層析柱中，用20 ml 的PBS 溶液平衡后，加入45 mg 的人 IgG 溶液，28 ℃、120 rpm 吸附1 h，然后加入8 ml 洗脫溶液，28 ℃、120 rpm 洗脫15 min，收集洗脫液。用可見紫外分光光度計(jì)在200～400 nm 進(jìn)行圖譜掃描，記錄278 nm 處的吸光度，即OD278。

吸附性能（mg/ml）=（(OD278×V洗脫（ml）×稀釋倍數(shù)）/1.38

注：1.38 為IgG 質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定系數(shù)。

二、結(jié)果與分析

（一）計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

通過(guò)測(cè)定，按照試驗(yàn)組的菌回收率大于50 %的要求，當(dāng)PHMB 濃度為0.04 %時(shí)，大腸埃希菌至少需要稀釋100 倍才能消除抑菌作用；銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉至少需要稀釋400 倍消除抑菌作用；金黃色葡萄球菌至少需要稀釋1000 倍才能消除抑菌作用。當(dāng)PHMB 濃度為0.15 %至少需要稀釋1500 倍才能消除抑菌作用（見表2）。

表2 各試驗(yàn)菌株的最低稀釋倍數(shù)

（二）不同濃度的PHMB 抑菌效力測(cè)定

PHMB 對(duì)細(xì)菌的抑菌作用較強(qiáng)，0.04 % 的PHMB 溶液對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抑菌作用均能達(dá)到2020 版藥典要求。0.04 %的PHMB 溶液對(duì)白色念珠菌的抑菌作用也能達(dá)到藥典要求，但是對(duì)黑曲霉的抑菌作用較弱，無(wú)法達(dá)到藥典要求（見表3）。

表3 不同濃度的PHMB 溶液抑菌效力測(cè)定

（二）不同濃度的PHMB 溶液對(duì)黑曲霉的抑菌作用

因PHMB 對(duì)黑曲霉抑菌作用較弱，單獨(dú)研究了提高濃度后的抑菌效力。結(jié)果表明，當(dāng)PHMB 濃度提高至0.15%時(shí)，對(duì)黑曲霉的抑菌效果可以完全滿足2020 版藥典的要求（見表4）。

表4 較高濃度PHMB 對(duì)黑曲霉的抑菌作用

（三）蛋白濃度的測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定不同時(shí)間所取樣品的蛋白濃度，重組蛋白A 初始濃度為5.04±0.22 mg/ml,放置3 個(gè)月后測(cè)定蛋白濃度為5.10±0.18 mg/ml,放置6 個(gè)月后測(cè)定蛋白濃度為4.85±0.11 mg/ml,放置9 個(gè)月后測(cè)定蛋白濃度為5.11±0.26 mg/ml,放置12個(gè)月后測(cè)定蛋白濃度為5.12±0.08 mg/ml。放置12個(gè)月后，蛋白濃度與初始值相比未下降。用SPSS 9.0軟件進(jìn)行單樣本T 檢驗(yàn)，測(cè)定第3、6、9、12 個(gè)月的樣品與0 個(gè)月的樣品差異不顯著（P=0.944），在誤差范圍內(nèi)認(rèn)為重組蛋白A 的蛋白濃度未下降（見圖1）。

圖1 不同時(shí)間下蛋白濃度的變化

（四）合成免疫吸附劑吸附性能測(cè)定

所合成的免疫吸附劑對(duì)人IgG 溶液的靜態(tài)吸附性能見圖2。合成的吸附劑初始吸附性能為29.06±0.37 mg/ml,放置3 個(gè)月后測(cè)定吸附性能為29.23±0.20 mg/ml,放置6 個(gè)月后測(cè)定吸附性能為28.72±0.43 mg/ml,放置9 個(gè)月后測(cè)定吸附性能為28.39±0.37 mg/ml,放置12 個(gè)月后測(cè)定吸附性能為28.12±0.59 mg/ml，吸附性能下降了3.23 %。用SPSS 9.0 軟件進(jìn)行單樣本T 檢驗(yàn)，測(cè)定第3、6、9、12個(gè)月的樣品與0 個(gè)月的樣品差異不顯著（P=0.159），說(shuō)明吸附劑的吸附性能未明顯下降，重組蛋白A 的活性下降在可接受范圍內(nèi)，重組蛋白溶液常溫放置12 個(gè)月后穩(wěn)定性良好。

圖2 不同時(shí)間下蛋白活性的變化

三、結(jié)論與討論

抑菌劑是指抑制微生物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)。中國(guó)藥典規(guī)定生產(chǎn)企業(yè)確定抑菌劑時(shí)必須評(píng)價(jià)抑菌劑的抑菌效力，所有抑菌劑都具有一定的毒性，所以制品中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效劑量［9］。PHMB 殺菌原理是PHMB·HCl 中的胍基有很高的活性，能使聚合物成正電性，很容易被呈負(fù)電性的各類細(xì)菌、病毒所吸附，從而抑制細(xì)菌病毒的分裂功能，使其喪失生殖能力，加上聚合物形成的薄膜堵塞了微生物的呼吸通道，使微生物迅速窒息死亡。PHMB 小鼠急性經(jīng)口LD50＞5000 mg/kg，屬無(wú)毒物質(zhì)，PHMB 是目前最安全無(wú)毒高效的消毒劑［3］。本研究通過(guò)測(cè)定PHMB 作為蛋白溶液中的抑菌劑的抑菌效果，結(jié)果顯示在低有效濃度為1.5 g/L 時(shí)能夠完全達(dá)到2020版藥典規(guī)定的A 類抑菌劑抑菌效力的要求，且對(duì)蛋白濃度及蛋白活性影響不大，可以作為蛋白溶液的抑菌劑進(jìn)行推廣應(yīng)用。