孫林春，劉建璟，張 利

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所，江蘇 南京 210008；2江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210009；3南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，4檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210009

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是致病因素引起的短時(shí)間內(nèi)腎臟功能急劇下降和/或腎實(shí)質(zhì)損傷，在臨床極為常見，在住院患者中的發(fā)生率為2%～12%，重癥監(jiān)護(hù)室患者可高達(dá)30%［1］。AKI 增加了腎臟病患者進(jìn)展到終末期的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致預(yù)后不良，尤其是同時(shí)發(fā)生腎功能下降和腎實(shí)質(zhì)損傷的患者［2］。引起AKI 的病因很多，如缺血-再灌注損傷、燒傷、藥物毒性、膿毒癥等，其中膿毒癥所致AKI 占臨床AKI的比例不斷增加，占到AKI病因的29.6%～47.6%［3］。AKI又能加重其他臟器損傷，引起多器官功能障礙。與非膿毒癥性AKI和單純膿毒癥患者相比，合并AKI的膿毒血癥患者預(yù)后明顯變差，病死率在50%～80%［4］。如何防治AKI 已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題，是腎臟病學(xué)及重癥醫(yī)學(xué)面臨的重要挑戰(zhàn)。

氧化應(yīng)激是膿毒癥腎損傷的重要機(jī)制之一。線粒體是腎小管細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源。膿毒癥時(shí)，腎組織受全身炎癥反應(yīng)的影響，ROS 生成增多，最終引起膿毒癥腎損傷［5］。調(diào)節(jié)ROS 和氧化應(yīng)激狀態(tài)可能成為膿毒癥腎損傷的潛在治療靶點(diǎn)。線粒體途徑是經(jīng)典的細(xì)胞凋亡信號通路。近來研究發(fā)現(xiàn)，ROS 爆發(fā)涉及線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［6］。腫瘤細(xì)胞局部高濃度ROS 能引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，跨膜電位降低，細(xì)胞色素釋放并激活半胱氨酸蛋白酶Caspase，通過下游級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致DNA堿基斷裂，誘導(dǎo)凋亡［7］。但膿毒癥腎細(xì)胞損傷中氧化應(yīng)激和Caspase途徑細(xì)胞凋亡的研究還較少。

模式識(shí)別分子通過模式識(shí)別受體作用于腎小管上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和組織細(xì)胞損傷。膿毒癥時(shí)，病原體相關(guān)分子模式被體內(nèi)的模式識(shí)別受體識(shí)別，引發(fā)炎癥反應(yīng)；革蘭陰性細(xì)菌外膜的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是目前膿毒癥中研究最多的外源性模式識(shí)別分子［8］。H2O2能在短時(shí)間內(nèi)提高細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平，且涉及多種信號通路，被廣泛用于體外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型［9］。本研究通過LPS 刺激建立人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 的膿毒癥細(xì)胞模型，用H2O2和Caspase 3特異性肽類抑制劑Ac-DEVD-CHO 單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)細(xì)胞，觀察Caspase 依賴的氧化應(yīng)激對腎小管上皮細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)作用，探討膿毒癥腎小管上皮損傷的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞購自中科院典型培養(yǎng)物保藏中心，用含10%胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

兔抗人Cleaved-Caspase 3 多克隆抗體、兔抗人Cleaved-PARP 多克隆抗體和兔抗人β-actin 多克隆抗體（ABI 公司，美國）；酶標(biāo)羊抗兔IgG（南京建成生物工程研究所）；H2O2、Caspae 3抑制劑Ac-DEVDCHO（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；MTT 試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒（BD 公司，美國）；DHE 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司，美國），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥細(xì)胞模型分組

用終濃度10 μg/mL 的LPS 處理12 h 建立膿毒癥細(xì)胞模型，分為：陰性對照組（不做處理）、過氧化氫組（H2O2300 μmol/L）、Caspase 抑制劑組（Ac-DEVD-CHO 15 μmol/L）、Caspase 抑制劑+過氧化氫組（H2O2300 μmol/L+Ac-DEVD-CHO 15 μmol/L），并以正常培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞為空白對照組。

1.2.2 Western blot檢測

提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行蛋白定量。80 V恒壓電泳30 min后，繼續(xù)用120 V 恒壓電泳至蛋白Marker 跑至距離膠底1 cm，停止電泳。用硝酸纖維素薄膜90 V 恒壓下電轉(zhuǎn)2 h。將蛋白膜用封閉液（含5%脫脂奶粉）室溫封閉2 h，再浸入用封閉液按1∶500 稀釋的一抗溶液中，4 ℃過夜；將蛋白膜用TBST 洗滌3 次，5 min/次后，再浸入用TBST 按1∶1 000 稀釋的二抗溶液中，室溫孵育1 h。洗膜后，用顯影劑顯色，用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)記錄并分析Cleaved-Caspase 3 和Cleaved-PARP蛋白條帶。

1.2.3 ROS檢測

將各組細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，按100 μL/孔加入流式管中，加入5 μmol/L DHE，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌后，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測

將細(xì)胞按1×103個(gè)/孔接種到96孔板，給予相應(yīng)處理，每組設(shè)6 個(gè)平行孔。分別在處理后的0 h 和48 h，每孔加入20 μL MTT溶液，置培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測

將各組細(xì)胞用胰酶消化后，用PBS 緩沖液制成1×105個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，按100 μL/孔加入流式管中，再分別加入20 μL Annexin V-異硫氰酸（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），和20 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）。另設(shè)單陽管和陰性對照管，室溫避光孵育20 min；再加入500 μL PBS 緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測

將各組細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，按100 μL/孔加入流式管中，加入1 mL PBS 和2 mL 無水乙醇，用封口膜密封管口置于4 ℃24 h，固定細(xì)胞。吸出上清液，加3 mL PBS重懸細(xì)胞，離心，向管底加入200 μL 50 mg/mL 的PI 染液，4 ℃避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2引起膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)

H2O2組腎小管上皮細(xì)胞Cleaved-Caspase 3 和Cleaved-PARP 蛋白表達(dá)較陰性對照組顯著升高（P＜0.05）；兩組Cleaved-Caspase 3和Cleaved-PARP蛋白均高于空白對照組（P＜0.05，圖1）。結(jié)果表明，H2O2能引起膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白異常表達(dá)。

圖1 各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 1 Expression of apoptosis-related proteins in each group

2.2 Caspase 抑制劑降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞ROS水平

空白對照組、陰性對照組、H2O2組、Caspase 抑制劑組和Caspase 抑制劑+H2O2組細(xì)胞中ROS 平均熒光強(qiáng)度分別為783±67、1 216±92、1 915±122、1 112±85 和1 623±100。陰性對照組中ROS 水平較空白對照組細(xì)胞升高（P＜0.05）；H2O2組ROS 水平較陰性對照組進(jìn)一步升高（P＜0.05），Caspase抑制劑+H2O2組細(xì)胞中ROS 水平較H2O2組降低（P＜0.05），但仍高于陰性對照組（P＜0.05，圖2）。結(jié)果說明，H2O2能提高膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞的ROS 水平，而Caspase 抑制劑能降低H2O2誘導(dǎo)的ROS 水平升高效應(yīng)。

圖2 各組細(xì)胞ROS水平檢測Figure 2 Detection of ROS levels in each group

2.3 Caspase 抑制劑削弱氧化應(yīng)激對膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞增殖的抑制作用

空白對照組、陰性對照組、H2O2組、Caspase 抑制劑組和Caspase 抑制劑+H2O2組細(xì)胞增殖率分別為（179.21±9.00）%、（153.57±7.40）%、（120.20±6.24）%、（159.21±8.25）%和（143.21±5.33）%。陰性對照組細(xì)胞增殖率低于空白對照組（P＜0.05），H2O2組細(xì)胞增殖率低于陰性對照組（P＜0.05），說明H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能抑制膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞增殖。Caspase 抑制劑+H2O2組細(xì)胞增殖率較H2O2組升高（P＜0.05），但仍低于陰性對照組（P＜0.05，圖3），說明Caspase 抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。

圖3 各組細(xì)胞增殖水平檢測Figure 3 Detection of cell proliferation in each group

2.4 Caspase 抑制劑抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞凋亡

由圖4可見，空白對照組、陰性對照組、H2O2組、Caspase 抑制劑組和Caspase 抑制劑+H2O2組的細(xì)胞凋亡率分別為（3.18±0.43）%、（6.25±0.40）%、（11.75±1.61）%、（5.01±0.78）%和（9.97±0.47）%。陰性對照組細(xì)胞凋亡率較空白對照組升高（P＜0.05），H2O2組細(xì)胞凋亡率較陰性對照組升高（P＜0.05）。Caspase 抑制劑+H2O2組細(xì)胞凋亡率較H2O2組降低（P＜0.05），仍高于陰性對照組（P＜0.05）。H2O2組細(xì)胞中Cleaved-Caspase 3 和Cleaved-PARP蛋白表達(dá)較陰性對照組升高（P＜0.05），Caspase抑制劑+H2O2組細(xì)胞中Cleaved-Caspase 3 和Cleaved-PARP 蛋白表達(dá)較H2O2組降低（P＜0.05，圖5）。結(jié)果顯示，H2O2能誘導(dǎo)膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而Caspase 抑制劑能抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖4 各組細(xì)胞凋亡檢測Figure 4 Detection of cell apoptosis in each group

圖5 各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 5 Expression of apoptosis-related proteins in each group of spesis

2.5 Caspase 抑制劑削弱氧化應(yīng)激對膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞周期的阻滯

由圖6 可見，空白對照組處于G1 期、G2 期和S期的細(xì)胞分別占（21.50±2.10）%、（32.63±2.76）%和（45.87±4.59）%。陰性對照組處于G1 期、G2 期和S期的細(xì)胞分別占（26.50±2.01）%、（27.63±3.34）%和（45.87±4.23）%。H2O2組處于G1 期、G2 期和S 期的細(xì)胞分別占（37.23±3.67）%、（15.39±2.10）%和（47.38±5.32）%。Caspase 抑制劑組處于G1 期、G2期和S 期的細(xì)胞分別占（28.67±3.87）%、（27.12 ±2.98）%和（44.20±5.10）%。Caspase 抑制劑+H2O2組處于G1 期、G2 期和S 期的細(xì)胞分別占（30.22±3.45）%、（21.01±3.44）%和（48.77±3.78）%。各組S期細(xì)胞比例無顯著差異（P＞0.05）。陰性對照組G1期細(xì)胞比例高于空白對照組（P＜0.05），H2O2組細(xì)胞G1 期比例高于陰性對照組（P＜0.05），說明H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能引起膿毒癥細(xì)胞周期紊亂，發(fā)生G1期阻滯。Caspase 抑制劑+H2O2組細(xì)胞G1 期比例低于H2O2組（P＜0.05），說明Caspase 抑制劑能逆轉(zhuǎn)H2O2對細(xì)胞周期G1期的阻滯作用，促進(jìn)周期進(jìn)展。

圖6 各組細(xì)胞G1期比例Figure 6 Proportion of G1 phase cells in each group

3 討論

膿毒癥是宿主在應(yīng)對感染時(shí)反應(yīng)失調(diào)而引起的一種器官功能障礙綜合征，臨床上50%的膿毒癥患者均有不同程度的腎損害，并且與膿毒癥的2 年死亡率密切相關(guān)［10，11］。大多數(shù)膿毒癥患者死于多器官衰竭，AKI是最常見的并發(fā)癥之一，是膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］，尋找膿毒癥急性腎損傷的特異性標(biāo)志物和有效的防治策略刻不容緩。

氧化應(yīng)激損傷是膿毒癥組織器官損傷的重要機(jī)制，且氧化應(yīng)激和膿毒癥全身和局部持續(xù)性炎癥反應(yīng)之間存在密切關(guān)聯(lián)。病原體及其釋放的毒素激活炎癥反應(yīng)及宿主釋放炎癥介質(zhì)會(huì)影響氧化呼吸鏈的偶聯(lián)過程，引起線粒體損傷和功能障礙，最終導(dǎo)致組織、器官損傷。膿毒癥大鼠肺組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活性升高［12］。產(chǎn)生的大量iNOS 源性一氧化氮對心肌細(xì)胞也有毒性作用，能抑制心肌產(chǎn)生ATP，引起心肌收縮障礙，最終導(dǎo)致膿毒癥心力衰竭［13］。氧化應(yīng)激也會(huì)對腎組織造成損傷，線粒體是腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞ROS的主要產(chǎn)生部位［14］。生理?xiàng)l件下，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的ROS維持在較低水平，對腎小管和腎微循環(huán)的生理調(diào)節(jié)有作用［15］；膿毒癥時(shí)，在各種炎癥因子的刺激下，腎小管和腎血管中ROS 生成增強(qiáng)，同時(shí)谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化物減少，ROS 攻擊腎小管細(xì)胞導(dǎo)致膜損傷及線粒體超氧陰離子滲漏，隨著細(xì)胞中ROS 濃度的進(jìn)一步增加，最終引起膿毒癥腎損傷［16］。以氧化應(yīng)激損傷為靶點(diǎn)的治療已經(jīng)成為近年來膿毒癥的研究熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，用LPS刺激腎小管上皮細(xì)胞后，細(xì)胞ROS水平明顯較正常腎小管上皮細(xì)胞升高，提示膿毒癥時(shí)腎小管細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平較生理狀態(tài)異常升高。本研究用H2O2處理細(xì)胞，ROS檢測顯示H2O2引起了細(xì)胞更高水平的氧化應(yīng)激損傷，結(jié)果顯示，與未經(jīng)H2O2處理的膿毒癥細(xì)胞模型相比，H2O2組細(xì)胞的增殖率降低，凋亡率升高，同時(shí)發(fā)生了細(xì)胞周期的G1期阻滯。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)告和本研究結(jié)果，我們更傾向于認(rèn)為ROS 對膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞有抑制增殖和周期進(jìn)展，誘導(dǎo)凋亡的作用，這與文獻(xiàn)中以緩解氧化應(yīng)激作為膿毒癥腎損傷治療的理論依據(jù)相吻合。

Caspase 是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，存在于胞質(zhì)中，線粒體途徑細(xì)胞凋亡的本質(zhì)是Caspase 依賴的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)［17］。本研究重點(diǎn)關(guān)注的正是ROS 與線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)Caspase-3/7，能破壞線粒體膜電位和上調(diào)ROS 水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，ROS 抑制劑能逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)［18］。原代大鼠軟骨細(xì)胞中過高水平的ROS能引起細(xì)胞色素c和Caspase-3高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。本研究用Caspase 抑制劑Ac-DEVD-CHO 聯(lián)合H2O2處理膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞ROS水平較H2O2組降低，但仍高于陰性對照組，說明H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在一定程度上具有Caspase 依賴性，抑制Caspase 能部分減弱膿毒癥腎小管上皮的氧化應(yīng)激損傷。細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)行為檢測顯示，Caspase抑制劑聯(lián)合H2O2處理的膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞增殖率較H2O2組升高，凋亡率降低，細(xì)胞周期處于G1 期的比例減少，說明氧化應(yīng)激損傷對膿毒癥腎小管細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的作用具有Caspase 依賴性，抑制Caspase 能逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激損傷對膿毒癥腎小管細(xì)胞的抑制增殖、促進(jìn)凋亡和引起細(xì)胞周期G1 期阻滯的效應(yīng)。但是，Caspase 抑制劑聯(lián)合H2O2處理組的細(xì)胞增殖、凋亡和G1 期細(xì)胞周期所占比例仍和陰性對照組有差異，說明抑制Caspase 只能部分影響氧化應(yīng)激對膿毒癥腎小管上皮的作用，提示氧化應(yīng)激可能還通過其他途徑對膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞造成損傷。Kaleem 等［20］研究顯示Caspase 釋放的功能受O2-調(diào)節(jié)，這與本研究結(jié)果相吻合。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為ROS造成的膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞增殖抑制、凋亡增加和細(xì)胞周期G1期阻滯效應(yīng)，部分是通過線粒體-Caspase 途徑實(shí)現(xiàn)的。通過直接降低ROS水平或阻斷線粒體-Caspase凋亡途徑，都能對膿毒癥時(shí)腎小管上皮細(xì)胞中異常升高的氧化應(yīng)激水平產(chǎn)生抑制作用，并通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖和周期進(jìn)展，減少細(xì)胞凋亡壞死，對腎小管上皮損傷起保護(hù)作用。但是除了線粒體-Caspase途徑，其他細(xì)胞凋亡通路是否也在膿毒癥腎小管損傷中發(fā)揮作用，目前尚不清楚，未來還需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。