劉易昕,何 強,張大鵬,嚴 坤,姚年偉,錢衛(wèi)慶
南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院骨傷科,江蘇 南京 210000
骨質(zhì)疏松是全世界范圍內(nèi)的健康難題,其發(fā)病與成骨、破骨代謝之間的失衡有關。促進骨形成、探究其相關分子生物學機制,對防治骨質(zhì)疏松具有重大意義。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BMSC)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞群,在體內(nèi)不同環(huán)境下可分化為成骨細胞、軟骨細胞以及脂肪細胞,其分化去向在全身的骨代謝中起到了重要作用[1],外部因素及其信號處理過程如何調(diào)控BMSC分化去向是當前研究的熱點。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是高度結構化的RNA轉(zhuǎn)錄本,長度超過200 個核苷酸,不直接參與蛋白的翻譯過程[2]。起初認為lncRNA 不具備生物學功能,近來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 可廣泛參與基因的表達調(diào)控,調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡,并與個體的生長發(fā)育相關[2]。研究表明,lncRNA 在基因水平對BMSC的調(diào)控起重要作用,參與BMSC 分化調(diào)控過程中復雜的信號通路,從而間接調(diào)控骨質(zhì)疏松疾病的發(fā)生和發(fā)展[3-6],但具體調(diào)節(jié)機制仍不明確。本研究擬通過制備卵巢切除骨質(zhì)疏松模型,并培養(yǎng)骨質(zhì)疏松模型大鼠的BMSC,對細胞內(nèi)lncRNA 進行檢測,對比研究相關差異lncRNA 基因的生物學功能及參與的相關信號通路,為后期進一步的驗證及功能研究提供基礎。
選取雌性SD 大鼠12 只,體重(250±10)g,由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。所有實驗均通過南京市中醫(yī)院倫理委員會批準同意。12只SD大鼠分為對照組和骨質(zhì)疏松組,每組6 只。骨質(zhì)疏松組采用切除卵巢的方法制作模型,對照組僅采用腹部切開不作卵巢切除,均飼養(yǎng)3個月。3個月后每組取3只SD大鼠的BMSC用于基因芯片檢測。
1.2.1 SD大鼠卵巢切除骨質(zhì)疏松模型建立
根據(jù)文獻方法制作SD大鼠骨質(zhì)疏松模型[7],采用10%水合氯醛以1 mL/250 g的劑量腹腔內(nèi)注射麻醉,待麻醉滿意后大鼠腹部剪毛,采用碘伏進行局部皮膚消毒,沿著腹部中線中下部正中作2 cm長切口,將皮膚牽開,切開腹膜,進入腹腔,沿雙側(cè)子宮外上角的輸卵管找到卵巢,絲線結扎卵巢蒂部,切除大鼠卵巢并取出,縫合腹膜和皮膚切口。對照組SD大鼠僅切開腹部后沿著輸卵管顯露卵巢,但不作卵巢切除,縫合腹膜及皮膚。
1.2.2 骨密度(bone mineral density,BMD)檢測
根據(jù)實驗設計,在實驗開始時和飼養(yǎng)3 個月后分別檢測SD 大鼠的骨密度并進行比較。采用10%水合氯醛以1 mL/250 g 劑量腹腔內(nèi)注射麻醉,待麻醉滿意后,將其四肢展開俯臥于雙能X 線吸收測量儀(GE 公司,美國)平臺上,通過小動物軟件測定系統(tǒng)測定各組小鼠全身骨骼的骨密度。
1.2.3 BMSC的分離提取、培養(yǎng)及鑒定
飼養(yǎng)3個月后的SD大鼠,根據(jù)文獻介紹方法[8],取大鼠右側(cè)股骨干,無菌條件下沿兩側(cè)干骺端剪斷,暴露骨髓腔,并以1 mL 無菌注射器吸取培養(yǎng)基反復沖洗,直至流出的液體變?yōu)榍辶敛⑶夜堑念伾l(fā)白;用移液器將含有小鼠骨髓液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,輕柔吹打,去除殘渣,經(jīng)離心、重懸后以1×106個/瓶的濃度接種于培養(yǎng)皿內(nèi),置于培養(yǎng)箱中,每隔2 d 更換1 次培養(yǎng)液,待細胞融合約80%~90%時進行傳代操作。選取第3代BMSC,常規(guī)消化并制備細胞懸液,1 000 r/min 室溫離心5 min 后PBS緩沖液重懸細胞,并調(diào)整濃度5×106個/mL加入流式細胞管,在避光條件下按說明書每管分別加入熒光標記的CD45、CD90抗體,4 ℃避光孵育1 h,對細胞進行1 000 r/min 室溫離心5 min 后PBS 洗滌3次,將細胞重懸于加入約1 mL PBS緩沖液,運用流式細胞儀檢測并計算陽性細胞的比例,結果顯示CD45+細胞比例<1%,而CD90+細胞比例>95%。
1.2.4 基因芯片檢測差異lncRNA
根據(jù)實驗設計,取飼養(yǎng)3 個月后的骨質(zhì)疏松模型組大鼠3 只和對照組大鼠3 只,培養(yǎng)其BMSC,利用基因芯片技術檢測BMSC內(nèi)差異lncRNA。
在Illumina TruSeq?RNA 樣品準備試劑盒使用說明書指導下進行RNA提取及文庫的制備,最后進行PCR 富集得到最終的cDNA 文庫。利用Trimmomatic(v0.32)進行基因數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾,保留基因質(zhì)量在20 以上的堿基?;虿町惐磉_的計量數(shù)據(jù)為基因表達水平分析中得到的readcount 數(shù)據(jù)。采用deseq進行分析,采用Quantile的Normalization方法,選取P<0.05、差異倍數(shù)>2即|log2FC|>1的基因作為差異表達的基因列出。
1.2.5 GO功能和KEGG信號通路富集度分析
通過GO 分類號和GO 數(shù)據(jù)庫相關分析工具將分類與具體基因聯(lián)系起來,對基因的功能進行描述,通過分析明確差異基因主要參與的生物功能。對差異表達lncRNA 的共表達靶基因mRNA 做KEGG 信號通路富集分析,判定差異基因主要影響的生物學功能或者信號通路。
采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示。采用Shapiro-Wilk法檢驗數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布,對符合正態(tài)分布的計量資料,兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗,多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
所有12只大鼠均順利完成手術并飼養(yǎng)3個月。骨質(zhì)疏松模型組和對照組SD 大鼠術前骨密度差異無統(tǒng)計學意義[(182.33±4.50)mg/cm2vs.(184.17±4.49)mg/cm2,P>0.05];骨質(zhì)疏松模型組SD 大鼠3 個月后骨密度為較對照組大鼠顯著降低[(157.33±6.28)mg/cm2vs.(183.33±4.50)mg/cm2,P<0.05],同時較切除卵巢前顯著降低(P<0.05,圖1)。
圖1 SD大鼠骨密度檢測Figure 1 Bone mineral density of SD rats
骨質(zhì)疏松模型組和對照組SD 大鼠BMSC 內(nèi)檢測出基因片段共計32 759 個,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的有8 454個,其中上調(diào)3 593個,下調(diào)4 861個。檢測到的lncRNA基因片段共4 992個,按照|log2FC|>1、P<0.05 的評價標準,骨質(zhì)疏松模型組和對照組大鼠BMSC 內(nèi)共116 個lncRNA 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),占所有l(wèi)ncRNA 基因的2.3%,其中上調(diào)35個,下調(diào)81個。聚類熱圖和火山圖分析結果提示差異譜結果可靠(圖2)。
圖2 SD大鼠BMSC內(nèi)的lncRNA表達情況Figure 2 LncRNA expression in BMSC of SD rats
通過高級分析最終篩選出18個lncRNA差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其|log2FC|值均在6 以上,其中上調(diào)的基因數(shù)為3個,占總數(shù)的16.7%,下調(diào)的基因個數(shù)為15個,占總數(shù)的83.3%。通過“cis”調(diào)控機制來預測差異lncRNA 的靶基因4 532 個,上述|log2FC|值均在6 以上的18 個lncRNA 的預測下游mRNA基因見表1。
表1 表達顯著差異的lncRNA列表及預測的靶向基因Table 1 List of significantly differentially expressed lncRNA and predicted target genes
對基因芯片技術檢測到的差異基因、同時又被預測為差異lncRNA 可能調(diào)控靶標的編碼基因,取交集共計273 個基因進行GO 分析、KEGG 信號通路富集度分析(圖3)。根據(jù)GO 功能分析,生物學過程(BP)中基因分布前5 位的分別是發(fā)育過程(GO:0032502)、細胞生長(GO:0001558),解剖結構的發(fā)育(GO:0048856)、刺激反應(GO:0048583)和細胞蛋白代謝過程(GO:0032268)。細胞成分(CC)方面,顯著差異lncRNA 主要存在于異染色質(zhì)、與膜相連的細胞器、核內(nèi)腔、激活素A復合體內(nèi)。
圖3 差異lncRNA相關分析Figure 3 Results of differential lncRNA advanced analysis
差異lncRNA 主要富集的KEGG 信號通路,前5 個信號通路分別是:蛋白的轉(zhuǎn)運通路、味覺的傳導通路、核黃素的新陳代謝通路、泛酸鹽和輔酶A的生物合成通路與擴張型心肌病相關通路,這些通路可能間接調(diào)控骨質(zhì)疏松的病理生理過程。
隨著社會老年化人口的增加,骨質(zhì)疏松的發(fā)病率越來越高,其發(fā)病可以歸因于不平衡的成骨和破骨過程,但是其更詳細的發(fā)病機制尚不清楚。卵巢切除是制作骨質(zhì)疏松模型的方法之一[7]。通過對卵巢切除骨質(zhì)疏松模型與正常大鼠的骨密度結果對比發(fā)現(xiàn),卵巢切除3 個月后,SD 大鼠的骨密度顯著降低,進一步說明骨質(zhì)疏松模型制作成功。
BMSC 是成骨細胞、破骨細胞和脂肪細胞等的前體干細胞,其向不同方向分化對成骨形成和破骨吸收平衡作用至關重要[1]。抑制BMSC成脂、破骨分化,促進其成骨分化,糾正骨代謝失衡是治療骨質(zhì)疏松的研究方向之一[9-10]。在骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程中,lncRNA 參與了細胞增殖、凋亡和炎癥反應的調(diào)控,lncRNA在骨質(zhì)疏松中的具體作用機制尚不明確[11]。
lncRNA 對BMSC 的成骨分化發(fā)揮重要作用。通過對人BMSC 的研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)lncRNA ENST00000502125.2 可導致BMSC 內(nèi)的堿性磷酸酶染色強度明顯增強,染色結節(jié)的數(shù)也顯著增多,表明細胞向成骨性細胞分化[5]。lncRNA H19在BMSC成骨分化過程中表達顯著,miR-140-5p表達顯著降低,功能分析顯示lncRNA H19過度表達可抑制miR-140-5p 表達,加速成骨BMSC 分化,而lncRNA H19缺失則抑制了BMSC 的成骨分化過程,lncRNA H19可調(diào)控BMSC 分化過程[3]。同樣,lncRNA MEG3 的下調(diào)能顯著抑制BMSC 的成骨能力,其過表達則能提高BMSC 的成骨能力,其對成骨分化的調(diào)節(jié)作用可能是通過激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)來實現(xiàn)的[6]。
本研究中,在骨質(zhì)疏松模型大鼠BMSC 內(nèi)有116個lncRNA的表達差異具有統(tǒng)計學意義,占所有l(wèi)ncRNA 基因的2.3%,其中上調(diào)的lncRNA 35 個,下調(diào)81個。根據(jù)GO功能分析,這些差異lncRNA主要參與細胞生長發(fā)育、解剖結構發(fā)育的調(diào)控、對應激反應的調(diào)節(jié)、對細胞蛋白代謝過程的調(diào)控。差異lncRNA 主要富集的KEGG 信號通路包括蛋白的轉(zhuǎn)運通路、味覺的傳導通路、核黃素的新陳代謝通路、泛酸鹽和輔酶A的生物合成通路與擴張型心肌病相關通路,這些通路可能間接調(diào)控骨質(zhì)疏松的病理過程,本研究結果可為后續(xù)動物體內(nèi)體外實驗、臨床試驗等進一步探索并驗證lncRNA 對骨質(zhì)疏松發(fā)病的影響提供基礎。