闞雪純，何潤東，葛佳穎，吳 俊，苗登順

南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學系，江蘇 南京 211166

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量及骨組織微結(jié)構(gòu)異常為特征的代謝性骨疾病，好發(fā)于中老年人群以及絕經(jīng)后婦女，可導致骨脆性增加，顯著提高骨折的風險［1-2］。近年來，隨著社會老齡化問題的加重，骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率不斷提高，進一步加重了社會經(jīng)濟負擔，嚴重影響人類健康［3］。

目前針對OP 的防治藥物主要包括骨吸收抑制劑、骨形成促進劑以及骨礦化物，如雙磷酸鹽類、降鈣素、甲狀旁腺素等，但這些藥物只能改善患者臨床癥狀、延緩病情，并不能從根本上改善骨代謝情況，亦不能恢復成骨與破骨進程的動態(tài)平衡，并且存在一定的不良反應［3-5］。

作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學的主要治療方法，中醫(yī)根據(jù)臨床癥狀和體征將骨質(zhì)疏松歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇，其病因主要概括為腎精不足、脾胃虛弱、肝失條達和瘀血阻絡［6］。與西醫(yī)療法相比，中醫(yī)治療有單味中藥療法、復方制劑療法、針灸療法等，具有不良反應小，療效顯著的優(yōu)勢，可為OP 的防治提供新的方向［7-8］。續(xù)斷，又名川斷、川續(xù)斷，為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷的干燥根，因能“續(xù)折接骨”而得名。性微溫，味苦、辛，歸肝、腎經(jīng)。具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏的功效，臨床上常用于肝腎不足、腰膝酸軟、風濕痹痛、跌撲損傷、筋傷骨折、崩漏、胎漏等疾?。?］。已有研究證實，續(xù)斷可通過多種信號途徑參與骨形成與骨代謝過程［4，10-11］，其活性成分皂苷可誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞方向分化從而能促進成骨細胞分化和礦化，因此有望用于OP的治療。

與化學藥物的藥理特征通常為單一成分相比，中藥尤其是復方制劑具有多成分、多靶點的特點［12］，其作用機制也更為復雜。然而近年來生物信息學、系統(tǒng)生物學以及多重藥理學的發(fā)展，使明確中醫(yī)藥發(fā)揮療效的分子機制以及基于復雜的生物系統(tǒng)探索中草藥配方成為可能［13］。網(wǎng)絡藥理學是融合多學科理論發(fā)展形成的一種新方法，它是在現(xiàn)代藥理學研究的基礎上提出的一種新的藥物設計與開發(fā)方法和策略。網(wǎng)絡藥理學促進了醫(yī)學研究從之前的“單一靶點、單一藥物”向“多靶點、多藥物”這一新模式的轉(zhuǎn)變，為新藥開發(fā)提供了新途徑和新策略［14］。本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法，分析續(xù)斷的有效活性成分、作用靶點及其可能的作用機制，同時通過網(wǎng)絡分析的方法進一步預測續(xù)斷抗OP 的靶點，并對相關(guān)靶點進行通路富集分析，探討續(xù)斷治療OP的潛在作用機制。

1 資料和方法

1.1 資料

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）［15］，以口服生物利用度（oral bio-availability，OB）≥30%、藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18［16］為指標篩選續(xù)斷活性成分。同時采用TCMSP 靶點預測模型對相關(guān)活性成分作用靶點。再將靶點在Uniprot 數(shù)據(jù)庫［17］中進行搜索，選擇物種設置為人，對搜集篩選得到的靶點蛋白或基因信息進行校正，獲得靶點標準的Uniprot名稱，將續(xù)斷每種活性成分的靶點集與疾病靶點集進行映射取交集，得到續(xù)斷抗OP 的有效成分。

1.2 方法

1.2.1 OP相關(guān)靶基因的獲取以及中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建

在疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫（GeneCards數(shù)據(jù)庫［18］和Dis-GeNET 數(shù)據(jù)庫［19］）中分別以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索與OP相關(guān)的靶基因，獲得的基因集作為疾病靶點，并將其與續(xù)斷作用靶點在軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中取交集后獲得續(xù)斷-OP 疾病交集靶點。最后利用Cytoscape 軟件構(gòu)建“續(xù)斷活性成分-靶蛋白-疾病”交互網(wǎng)絡。選取節(jié)點度（Degree）大于中位數(shù)4 倍的靶蛋白，并進行數(shù)據(jù)可視化處理，得到中藥-成分-疾病-靶標調(diào)控網(wǎng)絡。

1.2.2 GO富集分析與KEGG通路分析

通過Enrichr 在線工具［20］進行交集靶點的基因本體論（GO）分析以及KEGG通路富集分析，并對具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）的結(jié)果進行可視化處理。

1.2.3 中藥-疾病靶標蛋白互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建與核心

利用STRING在線軟件［21］將所得14個基因交集靶點輸入軟件，篩選條件為種屬選擇人，最小互作分數(shù)值為0.4，構(gòu)建續(xù)斷治療OP 的基因PPI 網(wǎng)絡。利用Cytoscape軟件中的插件Cytohubba，根據(jù)MCC、Degree、Betweenness等參數(shù)進行分析，對得分前3位的基因取交集，確認網(wǎng)絡中的核心靶點。

1.2.4 分子對接實驗

根據(jù)靶點預測結(jié)果，通過PDB數(shù)據(jù)庫［22］找到核心靶點蛋白的PDB-ID，使用PyMOL 軟件刪除水分子和小分子配體，通過PubChem數(shù)據(jù)庫［23］獲得調(diào)節(jié)核心靶點的分子活性成分結(jié)構(gòu)，使用ChemBio 3D繪制小分子的二維結(jié)構(gòu)，并將其保存為PDBQT 格式備用。將處理好的受體和配體分別保存為PDB 格式備用，并在AutoDock Vina 分子對接軟件下，對續(xù)斷活性成分和重要靶蛋白進行分子對接驗證。

2 結(jié)果

2.1 續(xù)斷活性成分及其靶基因

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索有關(guān)續(xù)斷中所有已報道的成分，并且按OB≥30%和DL≥0.18 作為篩選續(xù)斷潛在活性成分的標準，共獲得續(xù)斷活性化合物8 個（表1）。接著利用相關(guān)靶點預測技術(shù)預測上述活性成分作用靶點53 個，再以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中收集到4 273 和1 098 個相關(guān)疾病基因數(shù)據(jù)庫作為疾病靶點。將GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中獲得的相關(guān)化合物靶點與活性成分作用靶點取交集得到續(xù)斷作用靶點14個（圖1）。

表1 經(jīng)OB和DL篩選的續(xù)斷活性成分Table 1 Active ingredients of XuDuan screened by OB and DL

圖1 續(xù)斷作用靶點韋恩圖Figure 1 Venn diagram of XuDuan targets

2.2 中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析

通過GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫獲得OP 疾病相關(guān)靶點，并與續(xù)斷作用靶點取交集后獲得續(xù)斷-OP 疾病交集靶點14 個。然后，利用Cytoscape 軟件構(gòu)建中藥-疾病調(diào)控網(wǎng)絡（圖2）。由圖可見續(xù)斷主要通過龍膽根素、β-谷甾醇、林生續(xù)斷苷Ⅲ_qt 以及（-）-3，5-二咖啡?？鼘幩岬? 種活性成分作用于14個靶標基因影響OP的發(fā)生。

圖2 中藥-成分-疾病-靶標調(diào)控網(wǎng)絡Figure 2 Regulation network of XuDuan-compounddisease-target

2.3 續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松靶蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選

將疾病靶點與有效成分靶點通過韋恩圖取交集得到的14個藥物-疾病靶點基因?qū)隨tring在線數(shù)據(jù)庫，以綜合得分（combined score）＞0.4 為閾值，構(gòu)建得到續(xù)斷抗OP靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖（圖3）。

圖3 續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松靶蛋白相互作用網(wǎng)絡Figure 3 Network of XuDuan target genes on osteoporosis

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果

為了進一步明確續(xù)斷抗骨質(zhì)疏松的可能機制，利用Enrichr 在線工具分析上述靶基因參與的主要信號通路。GO 分析結(jié)果顯示，上述交集靶點的生物過程主要包括參與調(diào)控蛋白質(zhì)在細胞核中的定位、活性氧代謝、未折疊蛋白反應等；細胞組分主要包括高爾基體腔、球形高密度脂蛋白顆粒以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔；分子功能主要與芳香酯酶活性、羧酸酯水解酶活性和多巴胺跨膜轉(zhuǎn)運體活性等有關(guān)（圖4A～C）。KEGG 通路富集結(jié)果顯示，差異蛋白主要富集在與催乳素信號通路、利什曼病、結(jié)腸直腸癌等相關(guān)的信號通路中（圖4D）。

圖4 GO富集分析和KEGG通路分析Figure 4 Enrichment analysis of GO and KEGG of XuDuan target genes on osteoporosis

2.5 分子對接

利用Cytoscape 軟件中的插Cytohubba，根據(jù)MCC、Degree、Betweenness 等參數(shù)對2.3 中獲得的相互作用網(wǎng)絡進行分析，對得分前3位的基因取交集，確認MAPK14 和TGFB1 為網(wǎng)絡中的核心靶點。將MAPK14 和TGFB1 分別通過對接平臺AutoDock Vina 與續(xù)斷的活性成分Gentisin 和beta-sitosterol 進行分子對接，分別獲得20 個模型，Gentisin 與MAPK14（最低結(jié)合能為-6.2 kcal/mol）、beta-sitosterol 與TGFB1（最低結(jié)合能為-9.0 kcal/mol）的分子對接結(jié)果顯示（圖5）。一般認為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大，結(jié)合能≤-5 kcal/mol 時則視為成分與靶點有較好的活性，結(jié)合能≤-7 kcal/mol 時則結(jié)合活性強烈［24］。本研究結(jié)果說明續(xù)斷的活性成分和靶標之間具有良好的結(jié)合能力。

圖5 分子對接模式圖Figure 5 Docking model of of Xu Duan active ingredient with the key target molecule

3 討論

OP是一種由多因素導致的代謝性疾病，嚴重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量；目前臨床治療OP的藥物多為單一化合物的靶點治療，但僅能減輕OP的相關(guān)癥狀，且價格昂貴、不良反應較大，很難達到理想的治療效果。近年來，中草藥由于其本身具有的整體治療效果及具有不良反應小、療效顯著、可長期服用等特點，得到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

網(wǎng)絡藥理學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分［25］可用于進一步探究中藥治療疾病的物質(zhì)基礎和分子機制。本文利用網(wǎng)絡藥理學方法，構(gòu)建了續(xù)斷-活性成分-靶蛋白網(wǎng)絡及活性成分-靶蛋白-疾病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡；研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷的主要活性成分可通過多靶點、多基因影響OP的發(fā)生發(fā)展，可用于治療OP。

本研究證明續(xù)斷治療OP 的靶基因主要涉及MAPK14、TGFB1、NOS2、PTPN1、F2 等，這些基因可通過影響蛋白質(zhì)在細胞核中的定位、活性氧代謝、未折疊蛋白反應等生物過程，以及芳香酯酶、羧酸酯水解酶和多巴胺跨膜轉(zhuǎn)運體等功能蛋白的活性，從基因水平調(diào)控OP的過程。同時，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷治療OP 的核心靶標涉及的通路包括催乳素信號通路、利什曼病信號通路、結(jié)腸直腸癌信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥信號通路、肺結(jié)核信號通路等，它們分別從不同的生理學過程影響OP 的發(fā)生發(fā)展，使OP 與多種疾病產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。已有研究證實ESR1（ERα）被激活后可以抑制破骨細胞生長而促進成骨細胞增殖［26］，而在高雪等［27］的研究中指出甲狀腺素可作用于MAPK 通路，通過ER 促進基因轉(zhuǎn)錄和細胞增殖，由此可見MAPK 在骨質(zhì)疏松中的潛在作用。同樣，作為OP易感性的重要候選基因［28］，TGFB1 通過調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞以及成骨細胞的增殖分化在OP的發(fā)生發(fā)展中作用巨大［29-30］。

利用Cytohubba 篩選出關(guān)鍵靶點，進一步的分子對接預測發(fā)現(xiàn)續(xù)斷中的龍膽根素、β-谷甾醇與關(guān)鍵靶蛋白MAPK14、TGFB1 體現(xiàn)出良好的分子對接活性，顯示本研究數(shù)據(jù)較為準確，具有較高的可信度。

本研究在文獻檢索和活性成分篩選的基礎上，對續(xù)斷抗OP 有效成分進行了預測，并通過網(wǎng)絡藥理學的方法對續(xù)斷多成分、多靶點、多途徑的復雜作用機制進行了研究，預測了續(xù)斷治療OP 的潛在靶點，為進一步深入研究其作用機制提供了參考。