趙雅潔，施會(huì)敏，何田田，季嘉玲，甘衛(wèi)華，張愛青

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒腎科，江蘇 南京 210003

過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）是兒科常見的風(fēng)濕免疫性疾病，主要發(fā)生機(jī)制目前認(rèn)為是IgA介導(dǎo)的全身性小血管炎，臨床表現(xiàn)多樣。紫癜性腎炎（Henoch -Schonlein purpura nephritis，HSPN）是過敏性紫癜常見的臟器損害之一，腎臟損傷和HSP患兒的遠(yuǎn)期預(yù)后密切相關(guān)［1］。腎小球系膜增生性病變是HSPN 主要的病理表現(xiàn)之一［2］。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一種多功能細(xì)胞因子，目前多用于系膜細(xì)胞增殖的體外模型制備。ras反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（ras responsive element binding protein 1，RREB1）是我們采用多肽芯片技術(shù)篩選獲得，在HSPN 患兒病初血清中差異表達(dá)增多的一條多肽對(duì)應(yīng)的前體蛋白，與腎小球?yàn)V過率相關(guān)，廣泛參與了細(xì)胞生長和增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA 損傷修復(fù)過程［3］。本課題擬在體外觀察RREB1表達(dá)變化對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖的影響，探討RREB1 在系膜細(xì)胞增殖中的作用，進(jìn)一步探討HSPN的可能發(fā)生機(jī)制，為HSPN的診治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠系膜細(xì)胞（mesangial cell，MC）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清、胰酶、DMEM培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國），TGF-β1（R＆D 公司，美國），TRIzol 試劑（Thermo Fisher 公司，美國），PCR 檢測試劑盒（TaKaRa公司，日本），PCR引物由上海銳真生物公司合成，BCA試劑盒（南京凱基生物公司），鼠抗人GAPDH多克隆抗體購于（上海Abway公司），α-SMA抗體（常州Affinity 公司），PCNA、RREB1 抗體（Santa Cruz 公司，美國），PVDF 膜和顯影液（Milipore 公司，美國），HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（Proteintech公司，美國），CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8，同仁公司，日本），細(xì)胞周期檢測試劑盒（Everbright公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MC細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100 μL/mL，鏈霉素100 μL/mL）培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。待培養(yǎng)基中細(xì)胞生長至70%～80%時(shí)，用1 mL 0.25%胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至第3～8 代用于實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)期MC細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁且融合至70%～80%無血清培養(yǎng)基同步化12 h后，再進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染及干預(yù)處理24 h，用TGF-β1（10 ng/mL）［4］干預(yù)細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組如下：①空白對(duì)照組；②RREB1-siRNA 組；③NC 組（陰性對(duì)照siRNA）；④TGF-β1 組（10 ng/mL）；⑤TGF-β1+RREB1-siRNA組；⑥TGF-β1+NC組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

收集對(duì)數(shù)生長期MC細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，然后將細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至基本融合為一層，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先用無血清培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體、RREB1-siRNA和陰性對(duì)照，之后取等體積脂質(zhì)體和RREB1-siRNA或陰性對(duì)照輕柔混合，室溫孵育20 min后加入到培養(yǎng)好的細(xì)胞中，混勻后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力

收集MC細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，然后將細(xì)胞按比例接種于96 孔板中，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，按照實(shí)驗(yàn)安排分組預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞后向每孔分別加入10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃培養(yǎng)箱中培育1～4 h，用酶標(biāo)儀測量細(xì)胞在450 nm 處的吸光度值。每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，設(shè)置空白調(diào)零孔（只加DMEM 溶液和CCK-8溶液），以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR技術(shù)檢測目的基因mRNA的表達(dá)

細(xì)胞按組種板干預(yù)24 h 后，將1 mL TRIzol 試劑加入6 孔板內(nèi)，提取細(xì)胞總RNA，20 μL DEPC 水溶解，用Nanodrop 分光光度計(jì)檢測濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作制備cDNA，取適量產(chǎn)物配制10 μL PCR 反應(yīng)體系，用ABR7600 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。GAPDH為內(nèi)參，檢測α-SMA、PCNA 及RREB1 mRNA 表達(dá)。以2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers

1.2.5 Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)量

依照分組干預(yù)細(xì)胞24 h 后，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加入細(xì)胞裂解液，裂解液中含有RIPA、PMSF 和蛋白酶抑制劑（100 μL+1 μL+1 μL），使用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并于冰上裂解1 h，集于EP 管中，4 ℃12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法檢測蛋白濃度，稀釋至最小濃度，并加入1/4 體積5×上樣緩沖液，100 ℃金屬加熱器中變性5 min。用SDSPAGE電泳的方法分離蛋白質(zhì)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下5%BSA封閉1 h，加一抗（稀釋比例1∶1 000）于室溫孵育30 min，再4 ℃孵育過夜。次日室溫下復(fù)溫30 min后用1×TBST洗膜3次后，加二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h。1×TBST洗膜3次，加顯影液后用天能凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像的掃描及記錄。1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

收集各組細(xì)胞，加入75%冰乙醇，吹打均勻，-20 ℃固定過夜，上機(jī)前再次離心，加1 mL 冰浴預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，配制碘化丙啶染色液，每管加入500 μL 碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，室溫下避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism4 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對(duì)腎小球系膜細(xì)胞α-SMA及RREB1表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，TGF-β1 組系膜細(xì)胞α-SMA、RREB1 蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 TGF-β1對(duì)系膜細(xì)胞α-SMA及RREB1表達(dá)影響Figure 1 Expression of α-SMA and RREB1 protein levels in TGF-β1-mediated mesangial cell

2.2 RREB1-siRNA對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活力變化，結(jié)果顯示：TGF-β1組系膜細(xì)胞增殖活力明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與TGF-β1 組相比，TGF-β1+RREB1-siRNA 組細(xì)胞增殖活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 RREB1-siRNA 干擾對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effects of RREB1-siRNA interference on TGFβ1-mediated mesangial cell proliferation

2.3 RREB1-siRNA 對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，TGF-β1組α-SMA、PCNA等增殖相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3A、B）；與TGF-β1組比較，TGF-β1+RREB1-siRNA 組α-SMA、PCNA 等增殖相關(guān)基因mRNA 的表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，TGF-β1 組RREB1 mRNA 表達(dá)量增加；與TGF-β1 組比較，TGF-β1+RREB1-siRNA 組RREB1 mRNA 表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3C）。

圖3 RREB1-siRNA干擾對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖相關(guān)的影響Figure 3 Effects of RREB1-siRNA interference on proliferated mRNA of TGF-β1-mediated mesangial cells

2.4 RREB1-siRNA 對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，TGF-β1 組α-SMA、PCNA、RREB1 蛋白的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與TGF-β1組比較，TGF-β1+RREB1-siRNA 組α-SMA、PCNA、RREB1蛋白的表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖4）。

圖4 RREB1-siRNA干擾對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)影響Figure 4 Effects of RREB1-siRNA interference on proliferated proteins of TGF-β1-mediated mesangial cells

2.5 RREB1-siRNA對(duì)腎小球系膜細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組比較，TGF-β1 組G1 期細(xì)胞百分率明顯降低，G2、S 期細(xì)胞百分率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與TGF-β1 組相比，TGF-β1+RREB1-siRNA 組G1 期細(xì)胞百分率明顯增多，G2、S期細(xì)胞百分率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 RREB1-siRNA干擾對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞周期的影響Table 2 Effects of RREB1-siRNA interference on cycle of TGF-β1-mediated mesangial cells（%，，n=6）

表2 RREB1-siRNA干擾對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞周期的影響Table 2 Effects of RREB1-siRNA interference on cycle of TGF-β1-mediated mesangial cells（%，，n=6）

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與TGF-β1組比較，#P ＜0.01。

3 討論

HSPN 是繼發(fā)于HSP 的腎臟損害，是兒童時(shí)期最常見的繼發(fā)型腎臟病，系膜增生性病變是其主要的病理改變之一。但HSPN腎小球系膜細(xì)胞增生的病理生理機(jī)制尚未完全闡明。TGF-β1 是一種多功能的細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育及凋亡，在促進(jìn)腎小球病變發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［5］。TGF-β1可調(diào)節(jié)腎小球固有細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成分泌和沉積，是體內(nèi)外誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞活化最強(qiáng)有力的細(xì)胞因子［6］。目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在體外系膜細(xì)胞增殖模型的建立中。

PCNA 即增殖細(xì)胞核抗原，是反映細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)，與細(xì)胞周期密切相關(guān)，存在于正常增殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖周期的各個(gè)時(shí)期，其表達(dá)水平隨細(xì)胞增殖活性增加而升高［7］。在病理增殖情況下腎小球系膜細(xì)胞可以合成分泌大量α-SMA，α-SMA可以進(jìn)一步刺激系膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)腎臟纖維化［8］。本研究檢測了PCNA 及α-SMA 的表達(dá)情況，TGF-β1 干預(yù)后的系膜細(xì)胞上述兩種蛋白表達(dá)明顯升高，表明TGF-β1可引起系膜細(xì)胞病理性增殖。

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)HSPN 患兒存在1 條差異表達(dá)的多肽。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫分析前體蛋白的相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的多肽PPLVGSSALLSGTALLRPLRPKPPLLLPKPPVTE對(duì)應(yīng)的前體蛋白為RREB1［9］。RREB1是鋅指轉(zhuǎn)錄因子的一員，能夠與靶基因啟動(dòng)子上的ras 反應(yīng)元件相結(jié)合，廣泛參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及DNA 損傷修復(fù)等生物學(xué)過程［10］，在腫瘤、糖尿病、淋巴瘤及白血病等疾病中均有研究［11］。在胰腺癌患者中RREB1可激活細(xì)胞中長鏈非編碼RNA（AGAP2-AS1）的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移［12］。在直腸癌細(xì)胞中，AGAP2-AS1 調(diào)控Ras/MAPK 通路進(jìn)而影響細(xì)胞周期與增殖［13］。在腫瘤細(xì)胞中RREB1 作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中TGF-β1 激活的Smad 轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵伴侶，提供Ras 和TGF-β1 途徑之間的分子聯(lián)系，從而協(xié)同誘導(dǎo)發(fā)育性和纖維化EMT［14］。既往研究表明RREB1 是2 型糖尿病相關(guān)終末期腎病的新候選基因，且與腎小球?yàn)V過率相關(guān)，提示RREB1在腎臟損傷中發(fā)揮重要作用［15］。RREB1 還可誘導(dǎo)以及抑制許多基因的轉(zhuǎn)錄，有研究表明可誘導(dǎo)P53［16］、抑制P16［17］，而這些細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵基因的異常表達(dá)均參與了系膜細(xì)胞的異常增殖。但尚未有研究證實(shí)RREB1 與腎小球系膜細(xì)胞增殖之間的相關(guān)性。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在TGF-β1 誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖中，RREB1 的表達(dá)明顯增加，提示RREB1 在TGF-β1 誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖中可能發(fā)揮作用。為了探討RREB1是否參與了TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，我們使用siRNA 干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)RREB1-siRNA干擾后，TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖受到抑制，增殖相關(guān)基因PCNA表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖活力下降，并將細(xì)胞周期阻滯于G1 期，提示RREB1 這一ras 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的增殖具有重大影響，但其中的具體機(jī)制還有待闡明。報(bào)道表明RREB1 能被Ras 通路激活［18］，而Ras 通路在細(xì)胞增殖起主要作用。趙非等［19］發(fā)現(xiàn)Ki-RasA-c-Raf-MEK-ERK 這一信號(hào)通路獨(dú)立參與了醛固酮誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖。miR-34a 也通過PDGFR-β/Ras-MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞增殖［20］。本研究中RREB1 干擾后G1 期細(xì)胞明顯增多，提示RREB1干擾抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。

綜上所述，在TGF-β1 誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖中RREB1 上調(diào)，干擾RREB1 可抑制系膜細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，有望成為HSPN 診治的新靶標(biāo)，但其中的確切機(jī)制并不明確，有待今后進(jìn)一步研究。