劉 蘇，徐巍龍，查 敏，李 楠，周靜波，葉麗芳

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029

腎間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）進展至終末期腎病的主要病理途徑，轉(zhuǎn)錄因子Snail1介導(dǎo)的腎小管上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）通過旁分泌等作用，促進肌成纖維細胞的募集或增殖，是加速腎間質(zhì)纖維化的重要環(huán)節(jié)之一［1］。Snail1 受到多種微小核糖核酸（miRNA，miR）的調(diào)控［2］，血漿/血清外泌體包裹的miRNA 具有高穩(wěn)定性、源細胞特征及靶向功能性［3］，是體內(nèi)各組織/器官間細胞通訊的新途徑［4］，血漿外泌體miR-296-5p 與腫瘤細胞的EMT相關(guān)［5］，目前尚無miR-296-5p在DN血漿外泌體中表達及對腎小管上皮細胞EMT 影響的相關(guān)研究，因此，本研究擬通過DN小鼠模型，利用外泌體RNA測序及生物信息學(xué)分析等手段，明確miR-296-5p 在DN 小鼠血漿外泌體中的表達變化，并進一步探索其參與糖尿病腎病EMT進程的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

動物：10周齡SPF級健康雄性db/db小鼠12只，雄性db/m小鼠12只，體重20～45 g，由南京大學(xué)實驗動物中心提供［動物許可證號：SCXK（蘇）：2018-0008］。

主要試劑：exoRNeasy Midi Kit（Qiagen 公司，美國）；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stemloop）、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物）；Snail1 野生型雙熒光素酶報告質(zhì)粒、Snail1突變型雙熒光素酶報告質(zhì)粒（安徽通用生物）；miR-296 mimics、NC（蘇州吉瑪基因）；293T 細胞（ATCC，美國）；LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美國）；DMEM 高糖、FBS（Hyclone 公司，美國）；青鏈雙抗（上海生工生物）；雙熒光檢測試劑盒（Promega公司，美國）；蘇木素-伊紅染液試劑盒（南京凱基生物）。

主要儀器：熒光定量PCR儀（ABI7300）、細胞培養(yǎng)箱（Thermo）、熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS，IX71）、超凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司）、低溫冷凍離心機（Sigma 3K15）、脫色搖床（海門市其林貝爾TS200A）、發(fā)光檢測儀（Molecular Devices SpectraMax?i3）、超速離心機（Himac CP80WX）、透視電子顯微鏡（Tecnai）、ZetaView Particle Metrix（Particle Metrix）。

1.2 方法

1.2.1 分組及取樣

首先選取6只10周齡db/db小鼠為模型組，6只10周齡db/m小鼠為對照組，在南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，麻醉后對小鼠行眼眶采血致死，血漿混樣后行外泌體RNA 測序及生化檢測。完成差異miRNA 篩選后，再次選取6 只10 周齡db/db 小鼠為模型組，6 只10 周齡db/m 小鼠為對照組，重復(fù)上述飼養(yǎng)及處死流程，血漿混樣后行外泌體鑒定及外泌體miRNA 驗證。24 h 尿液標(biāo)本利用代謝籠收集。腎組織標(biāo)本部分凍存于液氮中，用于RNA和蛋白提取；部分保存于多聚甲醛，包埋后用于Masson 染色及免疫組化。動物實驗按照南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會規(guī)定進行操作，倫理批件編號：IACUC-2103058。

1.2.2 小鼠生化指標(biāo)檢測

血、尿標(biāo)本送南京潤太醫(yī)學(xué)檢驗有限公司實驗室，測定血尿素（BUN）、血肌酐（Scr）、血胱抑素C（Cys-C）、空腹血糖（FBG）、24 h尿蛋白定量（Upro）。

1.2.3 小鼠血漿外泌體miRNA測序

分別取2 mL db/m 組和db/db 組小鼠血漿，送上海其明生物技術(shù)有限公司進行血漿外泌體miRNA測序，并利用生物信息學(xué)軟件進行分析。按|log2FC|值由高到低進行驗證。

1.2.4 血漿外泌體提取

分別取2 mL db/m 組和db/db 組小鼠血漿，采用差速超速離心法，予300g，4 ℃離心10 min；取上清液，2 000g4 ℃離心10 min，12 000g4 ℃離心30 min；120 000g4 ℃離心70 min，取透明沉淀重懸于PBS，所得即為外泌體溶液；取其中20 μL，加入PBS后再次120 000g4 ℃離心70 min，取透明沉淀重懸于PBS，所得即為電鏡使用。

1.2.5 透視電子顯微鏡及納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analyze，NTA）鑒定外泌體

外泌體樣本靜置于銅網(wǎng)上1 min，2%醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min，將染色完成的樣本放于燈下烤10 min，透射電鏡觀察拍照，保存圖片。外泌體樣本以1×PBS buffer 稀釋，使用ZetaView PMX110進行NTA，結(jié)合Stockes-Einstein 方程式計算外泌體粒徑和濃度。

1.2.6 小鼠血漿外泌體RNA提取

使用QIAGEN exoRNeasy Midi Kit 試劑盒直接提取血漿外泌體RNA，步驟為：加等體積Buffer XBP到樣品中，500g離心1 min；5 000g離心1 min，將離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中，加700 μL QIAzol 到膜上，5 000g離心5 min，收集裂解液，室溫孵育5 min；加入90 μL 氯仿，震蕩15 s，室溫孵育2～3 min，4 ℃12 000g離心15 min；轉(zhuǎn)移上層水相到新的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻；轉(zhuǎn)移混合樣品到離心柱中，放入2 mL收集管中，室溫，＞8 000g離心15 s；加700 μL Buffer RWT到離心柱中，＞8 000g離心15 s；加500 μL Buffer RPE到離心柱中，＞8 000g離心15 s，重復(fù)這一步驟；將離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中，開蓋全速離心5 min使膜晾干；將離心柱放入新的1.5 mL離心管中，加14 μL水到膜中央，室溫放置1 min，全速離心1 min，獲得的RNA放-80 ℃冰箱備用，行血漿外泌體miRNA驗證。

1.2.7 實時定量qPCR（RT-qPCR）檢測

外泌體RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 反應(yīng)體系及程序參照試劑說明書，miR-296-5p 和Snail1 mRNA 的表達情況用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析，分別以U6 和GAPDH 為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 用于RT-qPCR的引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.8 生物信息學(xué)分析

利用TargetScan、miRanda軟件，預(yù)測靶向Snail1的miRNA，取兩種軟件預(yù)測結(jié)果的并集。mmu-miR-296-5p成熟體序列來自miRBase 數(shù)據(jù)庫。利用TargetScan 軟件預(yù)測mmu-miR-296-5p 與Snail1 的結(jié)合位點，根據(jù)結(jié)合位點堿基序列設(shè)計突變型載體序列，突變序列為：5′-ACATGTCCAGGTGCCCCTGGGCCTGGGCAACTGTTTCAGCCCCCGCCCCCAT -TTGTCCTGGTGACACCTGTTTCACAGCAGTTTAACTGTCTCAGAAGGGACCATGAATAATGGCCATCACTTGTTAGGGGCCAAGTGGGGTGCTTCAGCCTGGC -CAATGTGTCTCCCAGAACTATTTTCCCCGGGTACAGGTGGCCCCGGGAGAAAGATGTTTACATTTTAAAGGTATTTATATTGTAAGCAGCATTTTGTATAGTTAATATGTACAGT T T ATTGATATTCAATAAAATGGTTAATTTATATACTAAAAA-3′（下劃線部分為結(jié)合位點突變后的基因序列）。

1.2.9 雙熒光素酶實驗

構(gòu)建野生型和突變型的Snail1-UTR 雙熒光報告質(zhì)粒（Snail1-WT，Snail1-MUT）。將對數(shù)生長期的293T 細胞以1×105個/mL 接種至24 孔培養(yǎng)板，每孔500 μL。將Snail1-WT、Snail1-MUT 與miR-296-5p mimics 和mimics NC 按照LipofectamineTM2000 說明書步驟轉(zhuǎn)染至293T 細胞，每組實驗設(shè)置3 個重復(fù)。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒步驟檢測熒光素酶活性。

1.2.10 小鼠腎組織病理學(xué)檢查

腎組織用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，4 μm 切片，Masson、HE染色后光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。免疫組化分析小鼠腎組織E-cadherin、α-SMA及Snail1蛋白表達。定量方法為將每個指標(biāo)db/m 組小鼠的染色面積作為1，db/db組小鼠的染色面積與db/m組小鼠的染色面積的比值即為該指標(biāo)的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5 軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用student-t檢驗；計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠代謝及生化指標(biāo)比較

與db/m組比較，db/db組小鼠24 h尿蛋白定量、血尿素、血肌酐、血胱抑素C、空腹血糖、體重均升高，其中Upro、FBG、體重升高顯著（P=0.003，P＜0.001，P＝0.020），符合2 型糖尿病腎病小鼠臨床表現(xiàn)（表2）。

表2 小鼠尿蛋白、腎功能、血糖及體重比較Table 2 Comparison of urine protein，renal function，blood glucose and weight in mice （，n=6）

表2 小鼠尿蛋白、腎功能、血糖及體重比較Table 2 Comparison of urine protein，renal function，blood glucose and weight in mice （，n=6）

2.2 小鼠血漿外泌體鑒定

電鏡視野下，兩組小鼠血漿均可見少量外泌體樣結(jié)構(gòu)（圖1）。NTA 結(jié)果顯示，db/m 組小鼠血漿外泌體的顆粒檢測濃度為6.4×107個/mL，平均粒徑132.1 nm；db/db組小鼠血漿外泌體的顆粒檢測濃度7.7×107個/mL，平均粒徑126.8 nm，均符合外泌體分布范圍，兩組血漿外泌體粒徑比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.890）。

圖1 透視電鏡及NTA技術(shù)鑒定小鼠血漿外泌體Figure 1 Characterization of mouse plasma exosomes by transmission electron microscope and NTA

2.3 小鼠血漿外泌體miRNA測序分析及驗證

db/m 組、db/db 組小鼠血漿外泌體行miRNA 測序，通過TargetScan、MiRanda軟件，并集篩選出32個靶向Snail1的差異miRNA，其中17個miRNA表達上調(diào)，15個miRNA表達下調(diào)（表3）。

表3 靶向Snail1的小鼠血漿外泌體差異miRNATable 3 Sequencing results of different plasma exosomal miRNA targeting Snail1

按照|log2FC|值由高到低順序，利用小鼠腎組織行RT-qPCR 驗證，優(yōu)先檢測TargetScan、MiRanda 軟件中重復(fù)的miRNA。結(jié)果顯示，與db/m 組相比，db/db 組小鼠腎組織mmu-miR-296-5p 降低，mmu-miR-34a-5p 升高（P=0.001，P=0.011），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。進一步利用小鼠血漿外泌體行RT-qPCR 驗證，發(fā)現(xiàn)db/db 組小鼠血漿外泌體中mmu-miR-296-5p 表達下降，mmu-miR-34a-5p 表達升高（P=0.011，P=0.013），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。結(jié)合|log2FC|值，選取miR-296-5p為本研究目標(biāo)miRNA。

圖2 RT-qPCR驗證小鼠腎組織miRNA表達Figure 2 Verification of miRNAs in mouse kidneys by RT-qPCR

圖3 RT-qPCR驗證小鼠血漿外泌體miRNA表達Figure 3 Verification of miRNAs in mouse plasma exsomes by RT-qPCR

2.4 雙熒光素酶實驗檢測mmu-miR-296-5p與Mus-Snail1的靶向關(guān)系

TargetScan 軟件預(yù)測mmu-miR-296-5p 與Snail1 3′UTR 的結(jié)合位點位于Snail1 3′UTR 區(qū)596～603 位置（圖4）。雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示：與miR-296-5p mimics NC組相比，miR-296-5p mimics組Snail1-WT 細胞的熒光素酶活性強度明顯降低（P＜0.001）；Snail1-MUT 細胞的熒光素酶活性強度無明顯變化（P=0.060）；Snail1-WT 細胞miR-296-5p mimics 組與Snail1-MUT 細胞miR-296-5p mimics組比較，熒光素酶活性強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003，圖5），證明miR-296-5p靶向結(jié)合Snail1。

圖4 Snail1與miR-296-5p的結(jié)合位點序列圖Figure 4 Sequence of the binding sites of Snail1 and miR-296-5p

圖5 雙熒光素酶檢測結(jié)果Figure 5 Results of dual luciferase assay

2.5 RT-qPCR檢測小鼠腎組織EMT相關(guān)基因表達水平

與db/m 組相比，db/db 組小鼠腎組織中E-cadherin mRNA 表達下調(diào)（P=0.012），α-SMA mRNA 表達上調(diào)（P=0.042），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Snail1 mRNA表達極度上調(diào)（P＜0.001，圖6），提示db/db 小鼠腎組織存在α-SMA陽性肌成纖維細胞增殖及Snail1介導(dǎo)的EMT。

圖6 RT-qPCR 檢測小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA 及Snail1 mRNA表達Figure 6 The mRNA expression of E-cadherin，α-SMA and Snail1 in mouse kidney by RT-qPCR

2.6 小鼠腎組織病理切片的觀察

Masson染色見db/m組小鼠腎小球大小正常，無腎小管擴張、萎縮，細胞外Masson 染色陽性面積小于視野面積的10%。db/db 組小鼠腎小球、腎間質(zhì)均見Masson 陽性染色，腎小管擴張明顯，細胞外Masson 染色陽性面積占視野面積的50%左右。HE染色見db/m 組小鼠系膜基質(zhì)無增多，腎小管上皮細胞形態(tài)正常；db/db 組小鼠腎小球中性粒細胞浸潤，系膜基質(zhì)增多，間質(zhì)見炎癥細胞、漿細胞浸潤（圖7）。db/db小鼠腎組織呈現(xiàn)間質(zhì)炎癥、纖維化的病理表現(xiàn)。

圖7 Masson、HE染色觀察小鼠腎組織形態(tài)學(xué)（×100）Figure 7 The morphology of mouse kidney by Masson and HE staining（×100）

2.7 免疫組化染色觀察小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Snail1蛋白表達水平

與db/m組相比，db/db組小鼠E-cadherin蛋白表達量下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.020）；α-SMA蛋白表達量有上升趨勢（P=0.152），但無統(tǒng)計學(xué)差異；Snail1蛋白表達量明顯增加（P=0.005，圖8）。

圖8 免疫組化染色觀察小鼠腎組織E-cadherin、α-SMA、Snail1的表達（×100）Figure 8 The expression of E-cadherin，α-SMA and Snail1 in mouse kidney by immunohistochemical staining（×100）

3 討論

腎間質(zhì)纖維化的主要特征是α-SMA 陽性肌成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)過度沉積，是DN 腎功能進行性下降的主要原因之一。目前研究顯示，腎小管上皮細胞EMT 不是肌成纖維細胞的主要來源［6］，而是通過誘導(dǎo)上皮細胞周期阻滯［7］、促進肌成纖維細胞分化及維持間質(zhì)炎癥等方式［8］，加速腎間質(zhì)纖維化。因此，明確EMT 的調(diào)控機制，對防治糖尿病腎病至關(guān)重要。

EMT 的本質(zhì)是上皮細胞向間充質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化的過程，在糖尿病背景下，損傷的腎小管上皮細胞E-cadherin表達下調(diào)，細胞喪失黏附特性，逐漸從基底膜上脫落，表達α-SMA 間充質(zhì)細胞表型，并通過斷裂的腎小管基底膜移行到腎間質(zhì)中。本研究中，12 周齡db/db 小鼠腎組織病理見間質(zhì)炎癥細胞浸潤，Masson 染色陽性；腎組織α-SMA 基因表達增加，蛋白表達有上升趨勢，符合早期DN腎小管間質(zhì)纖維化改變。與此同時，腎組織E-cadherin 基因和蛋白下調(diào)顯著，提示在DN 腎小管間質(zhì)病變早期即存在上皮細胞EMT，EMT與間質(zhì)炎癥及肌成纖維細胞增殖相關(guān)。本研究免疫組化檢測未見α-SMA 蛋白顯著上升，可能和造模時間短、腎間質(zhì)病變早期纖維化程度不嚴(yán)重有關(guān)。

E-cadherin 表達減少或缺失是EMT 的標(biāo)志，受到轉(zhuǎn)錄因子Snail1的調(diào)節(jié)［9］。在腎臟上皮細胞正常分化過程中，低表達的Snail1 可維持腎組織結(jié)構(gòu)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；而病理狀態(tài)下，升高的Snail1與E-cadherin 啟動子的E2-box 特異性結(jié)合，抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)E-cadherin 表達，觸發(fā)上皮細胞EMT［10］。既往文獻報道，Snail1 在糖尿病腎病、IgA腎病、微小病變腎病等多種腎臟疾病中均可升高，而在DN時升高顯著［11］。腎纖維化小鼠模型［12］及腎小管上皮細胞EMT 模型［13］進一步證實，升高的Snail1 可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞EMT。本研究db/db小鼠腎組織Snail1 基因及蛋白表達顯著增加，而E-cadherin 降低明顯，結(jié)合文獻資料，本研究提出，DN 時，腎組織局部Snail1 表達增加，通過下調(diào)E-cadherin，誘導(dǎo)了腎小管上皮細胞EMT。

Snail1又受到多種miRNA的靶向調(diào)控［2，14］，而血漿或血清中的miRNA 發(fā)揮調(diào)控功能需要外泌體介導(dǎo)。首先，外泌體是循環(huán)miRNA 的主要存在形式，其特殊的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)將miRNA 與外界核酸酶相隔絕，相比血循環(huán)中游離的miRNA，外泌體中的miRNA具有良好的生物穩(wěn)定性。其次，外泌體由來源細胞主動胞吐釋放到細胞外，其包裹的miRNA能夠直接反映機體的生理病理狀態(tài)，在癌癥［15］、脂肪營養(yǎng)不良［16］、心血管疾?。?7］等疾病中，循環(huán)外泌體miRNA表達譜呈特異性改變，是疾病診斷的新型標(biāo)志物。本研究通過小鼠血漿外泌體miRNA 測序及RT-qPCR 驗證，發(fā)現(xiàn)db/db 小鼠miRNA 在血漿外泌體中呈差異表達，其中miR-296-5p 顯著下調(diào)，可能是DN潛在的生物標(biāo)志物。本研究認為，miR-296-5p在db/db 小鼠血漿外泌體表達下降，是在糖尿病背景下，腎臟及腎外組織功能障礙的共同結(jié)果。首先，腎臟作為DN的主要病變器官，可能釋放富集差異表達miRNA 的外泌體［18］；其次，脂肪細胞被認為是循環(huán)外泌體miRNA 的主要來源［16］，在高糖背景下，包括腎臟、脂肪在內(nèi)的胰島素敏感組織均可出現(xiàn)功能障礙，血漿外泌體miR-296-5p的來源細胞有待后續(xù)研究進一步明確。

目前血漿外泌體miRNA 的研究多圍繞疾病診斷及病情評估，其靶向調(diào)節(jié)功能的相關(guān)研究甚少，血漿外泌體可通過直接融合胞膜或內(nèi)陷胞吞、水平轉(zhuǎn)移miRNA 等進入靶細胞，調(diào)控靶細胞基因。本研究miR-296-5p 在db/db 小鼠腎組織中表達下調(diào)，與血漿外泌體中表達一致，雙熒光素酶檢測提示，miR-296-5p與Snail1存在靶向關(guān)系，因此，本研究提出，表達下調(diào)的miR-296-5p可能通過血漿外泌體遞送，靶向上調(diào)腎小管上皮細胞Snail1，誘導(dǎo)腎小管上皮細胞EMT，加速DN腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，miR-296-5p在DN db/db 小鼠血漿外泌體中表達顯著下降，是DN 的潛在生物標(biāo)志物之一。同時，本研究在動物實驗水平提出，表達下調(diào)的miR-296-5p可能通過血漿外泌體遞送，靶向上調(diào)腎小管上皮細胞Snail1，誘導(dǎo)腎小管上皮細胞EMT，加速DN 腎間質(zhì)纖維化，但仍需通過細胞實驗及藥物干預(yù)實驗等進一步驗證。