吳子君，陳思沅，杜昭君，胡 雙，李海峰

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

脂肪酶是一種能夠分解甘油三酯的水解酶，可以在油水界面將甘油三酯轉(zhuǎn)化為甘油和脂肪酸。脂肪酶的來源十分豐富，可以從油料作物的種子[1]、動物的胰臟和脂肪[2]以及部分微生物[3]中獲取。其中，微生物脂肪酶具有種類繁多、作用溫度范圍廣以及底物特異性強等優(yōu)勢[4]，被廣泛應(yīng)用于食品[5]、藥品[6]、生物燃料[7]、皮革[8]、化妝品[9]、洗滌劑[10]等行業(yè)。在生物燃料方面，脂肪酶能夠催化植物油或其他不同來源的油脂，從而得到生物柴油，大大促進了資源的再生[11]。在醫(yī)藥方面，脂肪酶能夠拆分手性藥物，酶水解是一種重要的制藥方式[12]。在化工方面，可以利用脂肪酶水解法提高皮革質(zhì)量[8]；堿性脂肪酶可以替代一些化學(xué)洗滌劑，從而減少對環(huán)境的污染[13]。在食品方面，面團中加入脂肪酶可以起到增白的作用，且面團也會更筋道；用加入脂肪酶的面團做面包，口感和香味也有所增加[14-15]。

近幾年國內(nèi)外有關(guān)優(yōu)化脂肪酶發(fā)酵條件的研究報道有很多，例如：Behera等[16]考察了產(chǎn)脂肪酶葡萄球菌MTCC8 980發(fā)酵時的pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速等因素，采用響應(yīng)面試驗方法得到菌株最大酶活為1.86 U/mL；Salgado等[17]從橄欖加工廢水中篩選出1株產(chǎn)脂肪酶菌株(Magnusiomycescapitatus)，對氮源濃度以及氧利用率兩因素進行Doehlert設(shè)計，得到菌株所產(chǎn)脂肪酶活力為3.96 U/mL；賀勝英等[18]從玉米地土壤中篩選出1株伯克氏菌，采用單因素與正交試驗，優(yōu)化菌株產(chǎn)酶發(fā)酵的時間、pH值、碳源、氮源等因素，發(fā)現(xiàn)菌株所產(chǎn)的脂肪酶活力達到42.0 U/mL；王蕾等[19]通過單因素試驗和響應(yīng)面分析，對1株高產(chǎn)脂肪酶熱泉菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最終酶活達到224.63 U/mL。

研究表明，具有產(chǎn)脂肪酶能力的菌株有很多，但其中能夠產(chǎn)高脂肪酶活力的菌株卻很少[20]。目前，工業(yè)上通常采取微生物大規(guī)模發(fā)酵的方法來獲取脂肪酶[21]，隨著工業(yè)應(yīng)用對脂肪酶需求量的不斷增大，尋找新型脂肪酶生產(chǎn)菌株，并利用合理的試驗設(shè)計方法對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化以提高脂肪酶產(chǎn)量顯得尤為重要。

作者從發(fā)酵芝麻餅中篩選出1株產(chǎn)脂肪酶活力較高的菌株，對其進行分子生物學(xué)鑒定，通過單因素試驗，考察發(fā)酵時間、接種量、碳源、金屬離子、氮源、初始pH值對菌株產(chǎn)酶能力的影響，從而達到篩選和選育出高產(chǎn)優(yōu)勢菌株的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 樣品

實驗室自制的發(fā)酵芝麻餅。

1.1.2 主要試劑

聚乙烯醇1799型、棕櫚酸對硝基苯酯：上海麥克林生化有限公司；異丙醇、對硝基苯酚：天津市大茂化學(xué)試劑廠；阿拉伯樹膠粉：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；Trition X-100：天津市光復(fù)精細化工研究所。以上試劑除Trition X-100為化學(xué)純外，其余均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

Blue Pard電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；H1650-W微量臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；XMTD-4000 電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；PHS-3c精密pH計：上海大譜儀器有限公司；TS-200B恒溫搖床：上海天呈試驗儀器制造有限公司；Tecan Spark酶標儀：美國Bio Tek公司。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的配制參考景智波等[22]的方法，并進行適當修改。

改良中性紅油脂平板：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，菜籽油乳化液120 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，1.6%中性紅溶液1 mL，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL。

改良富集培養(yǎng)基：酵母膏2 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，(NH4)2SO41 g，NaCl 0.5 g，菜籽油乳化液12 mL，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL。

改良種子液培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，(NH4)2SO45 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨25 g，菜籽油乳化液12 mL，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL。

改良發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：(NH4)2SO41 g，葡萄糖5 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO41 g，蛋白胨30 g，菜籽油乳化液12 mL，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩

取5 g樣品放入45 mL的富集培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min富集48 h。吸取1 mL富集液于9 mL無菌水中進行梯度稀釋，選取10-2、10-3、10-4梯度菌液各200 μL于中性紅油脂培養(yǎng)基中均勻涂布，37 ℃培養(yǎng)48 h，選取變色菌落進行純化。

1.3.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的復(fù)篩

將初篩得到的3株產(chǎn)脂肪酶菌株接種于改良種子液培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)48 h。取1 mL發(fā)酵液置于離心管中，8 000 r/min離心10 min，以上清液作為粗酶液，測定菌株所產(chǎn)脂肪酶活力。選取產(chǎn)酶能力較強的菌株為后續(xù)試驗對象。

1.3.3 脂肪酶活力的測定

采用對硝基苯酚法，以棕櫚酸對硝基苯酯(p-NNP)為底物，測定脂肪酶活力，并繪制對硝基苯酚-吸光度標準曲線[22]。該法標準偏差較低，重現(xiàn)性好[23]。

y=115.4x-0.667 6，R2=0.997 5,

式中:y為對硝基苯酚濃度,μmol/L；x為吸光度(410 nm)。

脂肪酶活力計算參考文獻[24]。

1.3.4 產(chǎn)脂肪酶菌株的鑒定

對目的菌株進行16S rRNA基因的PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系：基因組DNA 1 μL，2×San Taq PCR Mix 12.5 μL，上游引物P0(GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)1 μL，下游引物P6(CTACGGCTACCTTGTTACGA)1 μL，加入ddH2O使反應(yīng)體系為25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃維持。擴增產(chǎn)物進行測序之后，將所得序列通過NCBI網(wǎng)站中GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響

將種子液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min的培養(yǎng)條件下，分別振蕩培養(yǎng)0、3、6、12、24、30、36、40、48、54、60、72、75 h后，取各時間段發(fā)酵液1 mL置于離心管中，8 000 r/min離心10 min，以上清液作為粗酶液，測定菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

1.3.5.2 接種量對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響

將種子液分別以1%、3%、5%、8%、10%、12%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，在最佳培養(yǎng)時間下測定菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

1.3.5.3 碳源對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響

考察誘導(dǎo)劑和碳源對該菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響，為此設(shè)置2組試驗：一組添加誘導(dǎo)劑(菜籽油)，同時考察不同碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、酵母、淀粉、糊精)對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響；另一組不添加誘導(dǎo)劑，考察不同碳源對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響。按最佳接種量，將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，在最佳培養(yǎng)時間下測定菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

1.3.5.4 氮源對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響

考察不同氮源(硫酸銨、硝酸鈉、酵母粉、蛋白胨、尿素、乙酸銨、氯化銨)對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加單一氮源，添加量為10 g/L，在37 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，其余條件為以上單因素試驗的最佳結(jié)果，在此基礎(chǔ)上測定菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

1.3.5.5 金屬離子對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.1 g/L的Cu2+、Zn2+、Fe2+、K+、Ca2+，以初始培養(yǎng)基中的金屬離子作為對照，在37 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，其余條件為以上單因素試驗的最佳結(jié)果，在此基礎(chǔ)上測定菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

1.3.5.6 初始pH值對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別設(shè)置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在37 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，其余條件為以上單因素試驗的最佳結(jié)果，在此基礎(chǔ)上測定菌株產(chǎn)脂肪酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

通過富集培養(yǎng)，根據(jù)中性紅油脂培養(yǎng)基的顯色結(jié)果篩選出3株產(chǎn)脂肪酶菌株，復(fù)篩后選定1株產(chǎn)脂肪酶活力較高的菌株，命名為K-2，其所產(chǎn)的脂肪酶活力為2.06 U/mL。確定該菌株為后續(xù)試驗對象。

2.2 菌株的鑒定

菌株K-2的菌落形態(tài)以及個體形態(tài)特征見圖1。由圖1可以看出：菌株K-2表面光滑，扁平，并且有黏性(圖1a)；顯微鏡下觀察，菌體成球桿狀(圖1b)。對菌株K-2進行16S rRNA基因序列測定，將所得序列通過NCBI網(wǎng)站中GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)菌株K-2與銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(Genbank登錄號為KF670598.1)的同源性最高，達到99.86%。應(yīng)用MEGA 10.2.6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。菌株K-2與銅綠假單胞菌聚于一支，親緣關(guān)系最近；因此，確定菌株K-2為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

圖1 菌株K-2的菌落形態(tài)和個體形態(tài)特征

圖2 根據(jù)菌株K-2的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 單因素試驗

2.3.1 培養(yǎng)時間對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

由圖3可知，當發(fā)酵時間為72 h時，菌株K-2所產(chǎn)脂肪酶活力達到最大值5.7 U/mL，之后繼續(xù)發(fā)酵，酶活力開始降低。這可能是因為隨著發(fā)酵時間的延長，菌體量過高導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)不足，且菌株進入平穩(wěn)期后產(chǎn)酶能力下降。這與曲威等[25]、麻瓊麗等[26]的研究結(jié)果一致。

圖3 培養(yǎng)時間對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

2.3.2 接種量對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

分別考察接種量為1%、3%、5%、8%、10%、12%時，對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響。由圖4可知，當接種量為3%時菌株所產(chǎn)脂肪酶活力最高，達到5.3 U/mL，隨著接種量的增加，菌株所產(chǎn)的脂肪酶活力下降。這可能是因為接種量過大，菌體對新的環(huán)境適應(yīng)力不強，營養(yǎng)物質(zhì)和氧含量的不適宜影響菌株的生長，進而降低菌株的產(chǎn)酶能力。

圖4 接種量對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

2.3.3 碳源對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，大部分菌株所產(chǎn)脂肪酶均為誘導(dǎo)型，需在培養(yǎng)基中加入一定量的誘導(dǎo)劑才能使菌株更好地產(chǎn)酶[27]。碳源對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響見圖5。在含誘導(dǎo)劑的試驗組以淀粉為碳源時，菌株所產(chǎn)的脂肪酶活力最高，酶活力為12.6 U/mL；不含誘導(dǎo)劑的試驗組同樣是在以淀粉為碳源時，菌株所產(chǎn)脂肪酶活力最高，酶活力為13.5 U/mL。同時發(fā)現(xiàn)，含誘導(dǎo)劑試驗組的菌液的D(600)在1.2～1.5之間，不含誘導(dǎo)劑試驗組的菌液的D(600)在0.8～1.3之間。因此，在本試驗中加入誘導(dǎo)劑能夠促進菌株的生長，但菌株所產(chǎn)脂肪酶活力沒有得到相應(yīng)的提高，這可能是因為該菌株最適誘導(dǎo)劑不是菜籽油，后續(xù)試驗可以考察誘導(dǎo)劑的種類對菌株產(chǎn)酶的影響。

圖5 碳源對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

2.3.4 氮源對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

氮源對菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響見圖6。由圖6可知:當以蛋白胨為單一氮源時菌株所產(chǎn)脂肪酶的活力最高，達到了243.7 U/mL；當乙酸銨作為單一氮源時，菌株能夠生長但酶活力受到抑制。王冬梅等[28]篩選出1株產(chǎn)脂肪酶的銅綠假單胞菌，經(jīng)單因素試驗優(yōu)化，最佳氮源為蛋白胨，最終菌株所產(chǎn)脂肪酶活力達到42 U/mL。

圖6 氮源對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

2.3.5 金屬離子對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

金屬離子通常會對菌株的產(chǎn)酶能力產(chǎn)生影響。由圖7可以看出：在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加Cu2+時，能夠?qū)晁a(chǎn)的脂肪酶活力起到促進作用，酶活力與對照組相比升高了12.2 U/mL；當添加Zn2+、Fe2+、Ca2+與K+時，會對菌株所產(chǎn)的脂肪酶活力起到明顯抑制作用，其中Fe2+的抑制作用最強，酶活力與對照組相比降低了82.7 U/mL。吳向萍[29]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+對短小芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌所產(chǎn)的脂肪酶活力起到促進作用。胡珺[30]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加Fe3+、Al3+對銅綠假單胞菌所產(chǎn)的脂肪酶活力起到促進作用，而添加Cu2+、Co2+則對酶活力產(chǎn)生抑制效果，這可能是由于菌株的生理特性不同，導(dǎo)致結(jié)果有差異。經(jīng)過SAS 9.0進行顯著性分析，發(fā)現(xiàn)在添加Cu2+后，菌株所產(chǎn)的脂肪酶活力與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 金屬離子對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

2.3.6 初始pH值對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

培養(yǎng)基的初始pH值也會對菌株的產(chǎn)酶能力起到重要作用。pH值能夠影響菌體對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的吸收和利用，進而影響生物的產(chǎn)酶能力[31]。由圖8可知：當發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值在4.0～9.0之間時，菌株K-2表現(xiàn)出很好的產(chǎn)酶能力，其所產(chǎn)脂肪酶活力均大于200 U/mL；當初始pH值為7.0時，菌株所產(chǎn)脂肪酶活力最高，酶活力為262.8 U/mL；當初始pH值為3.0時，菌株無法生長，因此未能檢測出酶活力。通常細菌產(chǎn)脂肪酶的最適初始pH值為中性或堿性，而菌株K-2在酸性條件下也有很好的產(chǎn)酶能力，證明該菌株所能適應(yīng)的pH值范圍較廣。

圖8 初始pH值對菌株K-2產(chǎn)脂肪酶活力的影響

3 結(jié)論

作者從實驗室自制的發(fā)酵芝麻餅中成功分離出1株產(chǎn)脂肪酶活力較優(yōu)菌株K-2，并通過16S rRNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，確定其為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，在改良發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，其初始脂肪酶活力為2.06 U/mL。通過單因素試驗得到銅綠假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件：淀粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，初始pH值7.0，培養(yǎng)溫度37 ℃，接種量3%，培養(yǎng)時間72 h，在此條件下菌株所產(chǎn)脂肪酶活力達到最大值，為262.8 U/mL，較優(yōu)化前有非常顯著的提高。作者所篩選的目的菌株的產(chǎn)脂肪酶活力雖高于一些研究報道，但距離工業(yè)化生產(chǎn)還有一定距離，后續(xù)可以通過硫酸銨沉淀、離子交換、凝膠層析等方法，純化菌株K-2所產(chǎn)脂肪酶，或者通過對菌株中的脂肪酶基因進行克隆，構(gòu)建工程菌株來提高脂肪酶的產(chǎn)量。