陳林林, 張佳欣, 李 偉, 王 玲, 宋佳琪, 辛嘉英,2

（1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 哈爾濱 150076;2. 中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730000）

脂肪酶屬于水解酶, 是最廣泛的生物催化劑之一, 具有專一性強(qiáng)、 反應(yīng)條件溫和以及可被生物降解等優(yōu)點(diǎn)［1-3］. 在食品領(lǐng)域, 脂肪酶常常用于改善食品的風(fēng)味, 延長(zhǎng)食品的貨架期等［4］. 然而, 天然的脂肪酶在高溫和有機(jī)溶劑等非自然環(huán)境中穩(wěn)定性較差, 催化反應(yīng)存在著不穩(wěn)定、 難以重復(fù)利用等問(wèn)題［1,5］. 為了克服上述不足, 建立了多種酶的固定化方法用來(lái)提高脂肪酶的催化性能和穩(wěn)定性. 傳統(tǒng)的酶固定化的方法主要有吸附法、 共價(jià)結(jié)合法、 包埋法及交聯(lián)法等［6］. Galina等［7］通過(guò)吸附法制備了多孔碳?xì)饽z固定化脂肪酶, 在合成脂肪酸酯時(shí)表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性, 可運(yùn)行數(shù)百小時(shí). 但傳統(tǒng)固定化方法制備過(guò)程繁瑣, 固定化酶的機(jī)械性能較差并且酶易失活［8-9］.

因此, 開發(fā)一種新型的高效酶固定化方法成為了目前研究的熱點(diǎn)［10］. 新型固定化酶方法主要有兩種: 一是基于改良酶的固定化開發(fā)技術(shù), 如微波輻射輔助固定化技術(shù)、 膜固定化技術(shù)等［11］; 二是選擇優(yōu)良的載體, 進(jìn)行固定化酶. 載體材料主要包括無(wú)機(jī)材料、 有機(jī)材料和復(fù)合材料［11-12］. 其中無(wú)機(jī)載體是一種可以直接從自然界中獲得或可以通過(guò)簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)材料固定酶的載體. Xu等［13］制備了鋱金屬-有機(jī)框架@二氧化錳納米復(fù)合材料, 并將由膽固醇氧化酶和磷酸銅自組裝制備的雜化納米花混合, 與游離酶相比, 固定化酶對(duì)膽固醇表現(xiàn)出相似的敏感性和特異性. 但無(wú)機(jī)雜化材料合成的過(guò)程相對(duì)復(fù)雜、在高濃度鹽、 高濃度底物和高溫的環(huán)境下易發(fā)生解吸等問(wèn)題, 如介孔二氧化硅雖具有較大的比表面積和孔隙率, 但卻面臨著酶易浸出和變性等穩(wěn)定性的問(wèn)題［14］. 因此, 通常在對(duì)酶進(jìn)行固定化時(shí)需要考慮操作情況、 成本以及是否會(huì)破壞酶活和穩(wěn)定性等方面［15］的問(wèn)題.

近年來(lái), 隨著納米技術(shù)的發(fā)展, 納米無(wú)機(jī)材料載體因其原料易得、 價(jià)格低廉、 不易分解且無(wú)毒無(wú)害等特點(diǎn)逐漸成為酶固定化的選擇. 2012年, 一種創(chuàng)新性雜化納米花固定化酶被提出［16］. 游離脂肪酶參與形成的脂肪酶雜化納米花（Lipase Hybrid Nanoflower, Lip-hNF）彌補(bǔ)了固定化酶技術(shù)的不足,為酶的固定化技術(shù)發(fā)展開辟了新的方向［17］. 該方法是由酶分子和金屬鹽無(wú)機(jī)自組裝形成的, 其合成過(guò)程分為3步: 成核、 異向生長(zhǎng)和形成花形［16,18］. 與其他固定化方法不同的是, 無(wú)機(jī)雜化納米花具有獨(dú)特的多孔花狀結(jié)構(gòu)及較大的表面積, 有利于傳質(zhì)過(guò)程的發(fā)生［19］, 還能夠有效地提升酶的利用率, 減少游離酶的浪費(fèi), 合成的固定化酶具有易回收可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn), 可以降低酶的使用成本, 同時(shí)可以改善酶的活性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性［18-20］. Zhong等［21］制備了高活性、 可循環(huán)利用的磁性活性的雜化酶, 與游離脂肪酶相比, 雜化酶的活性恢復(fù)率高達(dá)190%, 貯藏穩(wěn)定性和甲醇耐受性均有提高. Li等［22］研究了不同合成條件對(duì)雜化酶形狀和活性的影響, 其中用2價(jià)金屬離子合成的雜化酶活性高于用1價(jià)金屬離子或3價(jià)金屬離子合成的雜化酶催化活性. Jia等［23］采用反相微乳液法合成了帶有-NH2基團(tuán)的介孔二氧化硅納米花并將脂肪酶固定在合成無(wú)機(jī)納米材料上,制備的固定化酶表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和可回收性.

雜化酶的形成主要是基于金屬離子與酶分子胺基之間的相互作用, 不同種類的金屬離子會(huì)影響酶在雜化酶納米花中的活性, 能夠改變游離脂肪酶的結(jié)構(gòu)和形貌特征, 從而改變雜化酶的穩(wěn)定性和催化活性［24-25］. 我們利用酶-無(wú)機(jī)雜化技術(shù)對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶進(jìn)行固定化, 系統(tǒng)考察4種2價(jià)金屬離子Ca2+、 Zn2+、 Mn2+和Cu2+對(duì)合成雜化酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)、 最佳反應(yīng)條件下的催化活性、 耐受性和重復(fù)性的影響. 目的是制備出催化活性和穩(wěn)定性好、 耐受性和重復(fù)性高的雜化酶, 為探究固定化酶在實(shí)際中的應(yīng)用提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶水解活力為1828 U/mg; 氯化鈣, 購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司; 硫酸鋅、 磷酸氫二鈉、 磷酸二氫鈉和無(wú)水乙醇,購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司; 硫酸錳, 購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司; 硫酸銅, 購(gòu)自汕頭市西隴化工廠有限公司; 棕櫚酸對(duì)硝基苯酯, 購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司; 對(duì)硝基苯酚, 購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司; 甲醇, 購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠; 尿素, 購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司. 所有試劑均為分析純.

XT 220A 精密電子天平、 Z-16K 冷凍離心機(jī)、 UV-2550 紫外-可見分光光度計(jì)、 PerkinElmer Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀、 JEM-2100 型透射電子顯微鏡、 SU1510 掃描電子顯微鏡、 TGL-16高速臺(tái)式離心機(jī)、 HWS24電熱恒溫水浴鍋.

1.2 雜化脂肪酶制備

10 mL離心管中放入6 mL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS, pH=7.5）, 加入1 mL 1 mg/mL的脂肪酶和200 μL 200 mmol/L金屬鹽溶液（CaCl2, ZnSO4,MnSO4, CuSO4）, 混勻, 室溫下放置24 h. 離心, 蒸餾水洗滌3次, 凍干, 收集雜化脂肪酶［22］.

1.3 催化反應(yīng)條件對(duì)雜化脂肪酶活性的影響

1.3.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)雜化脂肪酶活性的影響

為了選擇合適的反應(yīng)時(shí)間, 稱取0.002 g 雜化酶添加到2.8 mL 100 mmol/L PBS（pH=8.0）中, 加入0.2 mL 10 mmol/L棕櫚酸對(duì)硝基苯酯（P-NPP）, 在不同反應(yīng)時(shí)間下（1、 5、 10、 15、 20、 30、 35和40 min）檢測(cè)反應(yīng)體系在400 nm處的吸光值, 確定最佳反應(yīng)時(shí)間［26］.

1.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)雜化脂肪酶活性的影響

為了優(yōu)化反應(yīng)溫度, 稱取0.002 g 雜化酶, 添加到2.8 mL 100 mmol/L PBS（pH=8.0）中, 加入0.2 mL 10 mmol/L P-NPP, 在不同反應(yīng)溫度下（25、 30、 40、50、 60和70 ℃）水浴, 檢測(cè)反應(yīng)體系在400 nm處的吸光值, 確定最佳反應(yīng)溫度［27-28］.

1.3.3 pH值對(duì)雜化脂肪酶活性的影響

為了檢測(cè)pH值對(duì)反應(yīng)的影響, 稱取0.002 g 雜化酶, 添加到2.8 mL 100 mmol/L PBS中, 加入0.2 mL 10 mmol/L P-NPP, 在最佳反應(yīng)溫度下, 不同pH值緩沖溶液中（7、 8、 9和10）檢測(cè)反應(yīng)體系在400 nm處的吸光值, 確定反應(yīng)最佳pH值［28］.

1.4 雜化脂肪酶包封率

采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定雜化酶制備過(guò)程中游離脂肪酶的包封率［24］. 配制一系列含不同濃度（0.0、 0.1、 0.3、 0.5、 0.8和1.0 mg/mL）游離脂肪酶的PBS標(biāo)準(zhǔn)溶液, 在270 nm下測(cè)定吸光度, A270nm為縱坐標(biāo), 游離脂肪酶濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到線性回歸方程:y= 0.2919x+ 0.0683. 分別測(cè)定不同金屬離子固定化酶反應(yīng)后上清液在270 nm處吸光度, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算出上清液中游離脂肪酶的濃度, 通過(guò)公式（1）計(jì)算雜化酶制備過(guò)程中游離脂肪酶的包封率.

式中:X為包封率;C0為游離脂肪酶濃度;Csample為上清液中游離脂肪酶的濃度.

1.5 雜化脂肪酶酶活測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置不同濃度（0、 0.03、 0.06、 0.09 和0.12 μg/L）的的對(duì)硝基苯酚（P-NP）乙醇溶液, 在紫外分光光度計(jì)400 nm下檢測(cè), 并記錄吸光值. 以P-NP 的濃度為橫坐標(biāo), A400nm為縱坐標(biāo), 得到線性回歸曲線:y=13.776x+ 0.036, 用于脂肪酶酶活的計(jì)算［29］.

1.5.2 對(duì)硝基苯酚法測(cè)酶活

酶活性測(cè)定建立在Zhang等［30］的檢測(cè)方法上:將0.002 g的雜化酶添加到2.8 mL 100 mmol/L PBS（pH=8.0）中, 加入0.2 mL 10 mmol/LP-NPP, 40 ℃孵育10 min, 加入1.5 mL丙酮以終止反應(yīng). 最后, 用紫外分光光度計(jì)在400 nm處檢測(cè)反應(yīng)溶液, 記錄吸光值A(chǔ)400nm, 以100 mmol/L PBS（pH=8.0）為空白溶液,400 nm處檢測(cè)記錄吸光值A(chǔ)0, 記算出酶活. 1個(gè)酶活力單位（U）定義為1 min內(nèi)生成1 μmol/L P-NP所需的脂肪酶的酶量.

1.6 雜化脂肪酶催化性能及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

配置不同濃度（6、 8和10 mmol/L）的底物P-NPP,稱取0.002 g 雜化酶置于4 mL離心管中, 加入 2.8 mL 100 mmol/L PBS（pH=8.0）和0.2 mL不同濃度的P-NPP, 最適溫度下雜化脂肪酶的酶促反應(yīng)速率, 利用米氏函數(shù)擬合數(shù)據(jù), 分別以1/V為縱坐標(biāo), 1/［S］為橫坐標(biāo)作圖, 根據(jù)雙倒數(shù)作圖法公式（2）、 公式（3）計(jì)算出Vm、Km和Kcat［31］.

式中:V為酶促反應(yīng)速率;Vm為最大反應(yīng)速率;Km為米氏常數(shù); ［S］為底物濃度.

式中:Kcat為催化常數(shù);Vm為最大反應(yīng)速率; ［S］為底物濃度.

1.7 雜化脂肪酶耐受性分析

取0.002 g的游離脂肪酶和雜化酶, 置于4 mL離心管中, 分別向每個(gè)離心管中加入1 mL的變性劑溶液（95%無(wú)水乙醇、 甲醇和6 mmol/L尿素）, 常溫下放置30 min后, 按1.5.2的方法直接測(cè)定酶活［25］.

1.8 雜化脂肪酶重復(fù)性分析

取2 mg 雜化酶, 置于4 mL離心管中, 向離心管中分別加入2.8 mL 100 mmol/L的PBS緩沖溶液（pH 8）和0.2 mL的底物, 振蕩混勻, 將離心管置于40 ℃的水浴鍋中反應(yīng)10 min后, 離心分離回收雜化酶,上清液用分光光度計(jì)在400 nm下讀取其吸光值. 回收的雜化酶用蒸餾水清洗3遍后, 加入2.8 mL 100 mmol/L的PBS緩沖溶液（pH=8）和0.2 mL的底物, 重復(fù)以上操作過(guò)程, 再次測(cè)定酶活, 連續(xù)測(cè)定3次. 將首次測(cè)定的雜化酶的酶活定義為100%. 其余次數(shù)測(cè)定的雜化酶的酶活, 計(jì)算其剩余酶活［32］.

2 結(jié)果與討論

2.1 雜化脂肪酶表征

2.1.1 雜化脂肪酶紅外光譜表征

傅立葉紅外光譜圖用于表征制備雜化酶化學(xué)鍵的變化. 圖1（a）所示游離脂肪酶在1415～1657 cm-1處的3個(gè)特征峰, 是肽鍵及其蛋白質(zhì)延伸的特征,如-NH2和C＝O; 3000～3200 cm-1處的寬而強(qiáng)的特征峰歸屬于-CH2和-CH3. 圖1（b）為Ca脂肪酶雜化納米花（Ca/hNF）, 與游離脂肪酶相比在928～1091 cm-1處觀察到多個(gè)P－O振動(dòng)和拉伸特征峰, 相對(duì)較小的波段在554～643 cm-1是PO43-的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)弱吸收峰, 證明了在雜化脂肪酶中磷酸根的存在; Ca/hNF的特征峰在1642和3000～3200 cm-1有所增強(qiáng), 表明游離脂肪酶被固定在Ca/hNF中, 1538和1425 cm-1處的酰胺特征峰消失, 說(shuō)明在雜化酶的形成過(guò)程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化. 這些結(jié)果表明所制備Ca/hNF中既含有磷酸根, 又含有游離脂肪酶.

圖1 游離脂肪酶和雜化納米花的傅立葉紅外光譜Fig.1 Fourier infrared spectroscopy of free-lipase and Ca/hNF（a）: free-lipase; （b）: Ca/hNF

采用紅外光譜圖探究由不同種金屬離子形成雜化酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響. 從圖2可知, 形成的Lip-hNF均觀察到PO43-和蛋白質(zhì)的特征峰, 證明了Ca2+、Zn2+、 Mn2+、 Cu2+這4種金屬離子均能與游離脂肪酶無(wú)機(jī)雜化, 改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu), 但其特征峰有著不同程度的增強(qiáng)或削弱, 其中Ca/hNF的磷酸根特征峰,酰胺Ⅰ帶特征峰最強(qiáng), 納米花結(jié)構(gòu)形成的最為明顯,Mn/hNF的磷酸根特征峰要強(qiáng)于Zn/hNF, Cu/hNF的納米花結(jié)構(gòu)較弱. 以上結(jié)果表明, 不同種的金屬離子對(duì)雜化酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)有不同程度的改變, 對(duì)合成Lip-hNF催化活性的影響不同.

圖2 雜化脂肪酶的傅立葉紅外光譜Fig.2 Fourier infrared spectroscopy of hybrid lipases（a）: Ca/hNF; （b）: Zn/hNF; （c）: Mn/hNF; （d）: Cu/hNF

2.1.2 雜化脂肪酶電鏡表征

為了進(jìn)一步了解脂肪酶雜化的納米花微觀形態(tài), 借助了掃描電鏡（SEM）、 透射電鏡（TEM）和激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）（如圖3所示）. 從圖3（a）, （b）可以看到該固定化酶體系的微觀結(jié)構(gòu)為花狀, 具有層級(jí)結(jié)構(gòu), 每一個(gè)納米花的大小約為1 μm. 透射電子顯微鏡圖3（c）進(jìn)一步顯示出的這種花狀結(jié)構(gòu), Ca/hNF為層級(jí)片狀結(jié)構(gòu), 可以看到金屬鹽離子的存在,具有較大的比表面積, 說(shuō)明了該結(jié)構(gòu)下的固定化酶相比游離酶會(huì)增加酶的活性. 此外, 為了確定脂肪酶分子在雜化酶中的固定情況, 在CLSM圖3（d）圖像中可以清楚地觀察到脂肪酶的熒光成像, 進(jìn)一步說(shuō)明脂肪酶在Ca/hNF中成功固定.

圖3 Ca/hNF的電鏡掃描圖Fig.3 Electron microscopic scan of Ca/hNF（a）, （b）: SEM; （c）: TEM; （d）: CLSM

2.2 催化反應(yīng)條件對(duì)雜化脂肪酶活性的影響

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)雜化脂肪酶活性的影響

考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)雜化酶催化活性的影響, 以確定雜化酶的反應(yīng)速率. 從圖4可看出4種Lip-hNF在反應(yīng)1～10 min內(nèi)吸光值在反應(yīng)體系中的濃度均隨著時(shí)間增長(zhǎng)而增加, 呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.01）, 10 min后反應(yīng)速率開始降低, 并趨于平穩(wěn). 其中Ca/hNF的水解速率要大于Zn/hNF、 Mn/hNF和Cu/hNF. 因此, 雜化酶催化水解反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為10 min.

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)雜化酶酶活的影響Fig.4 Effects of different reaction times on enzyme activity of hybrid enzymes

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)雜化脂肪酶活性的影響

反應(yīng)溫度會(huì)影響雜化酶的催化活性和熱穩(wěn)定性, 它是影響化學(xué)平衡常數(shù)的一個(gè)重要參數(shù). 結(jié)果如圖5所示, 4種Lip-hNF在反應(yīng)溫度為25～40 ℃時(shí)吸光值在反應(yīng)體系中的濃度均隨著溫度的增長(zhǎng)而增加, 呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.01）, 40 ℃后溫度升高, 反應(yīng)速率開始下降. 總體呈現(xiàn)出反應(yīng)速率均隨溫度的增高而先升高后降低的趨勢(shì), 與Li等［22］其自組裝制備的Ca/hNF變化趨勢(shì)一致. 這是因?yàn)殡S著溫度升高, 會(huì)加快雜化酶的催化反應(yīng)進(jìn)程, 但隨著溫度的持續(xù)升高, 酶的活性中心結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞, 導(dǎo)致雜化酶的水解活性下降或失活. 其中Ca/hNF在50 ℃時(shí)其水解活性為游離脂肪酶的197%, Mn/hNF的水解活性在50 ～70 ℃時(shí)要低于Cu/hNF. 表明了雜化酶的納米花結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶有保護(hù)作用, 展示出良好的熱穩(wěn)定性. 因此, 雜化酶的最優(yōu)反應(yīng)溫度為40 ℃.

圖5 不同反應(yīng)溫度對(duì)雜化酶酶活的影響Fig.5 Effects of different reaction temperatures on enzyme activity of hybrid enzymes

2.2.3 pH值對(duì)雜化脂肪酶活性的影響

考察pH值分別為7、 8、 9、 10的緩沖溶液對(duì)雜化酶催化水解能力的影響. 從圖6可知, 雜化酶在堿性條件下水解效果最佳, 在pH值為7～8范圍內(nèi),雜化酶的水解產(chǎn)物在反應(yīng)體系中的濃度隨著pH值的增加, 呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.01）. Ca/hNF、 Zn/hNF在緩沖溶液pH值為10時(shí)的水解活性分別為最佳水解活性的84.75%和78.86%, 能較好地維持雜化酶水解活力的穩(wěn)定性. Mn/hNF、 Cu/hNF在緩沖溶液pH值變化時(shí), 其穩(wěn)定性為最佳反應(yīng)pH的57.49%和58.98%. 可以得出不同種金屬離子不會(huì)改變水解反應(yīng)的最佳pH值, 與Zhang等［30］制備Zn/hNF呈現(xiàn)相同的趨勢(shì). 可以看出, 當(dāng)pH值為8時(shí)雜化酶的活力最大, 并在極端堿性的pH條件下, 其納米花結(jié)構(gòu)仍能保護(hù)脂肪酶不被破壞, 維持一定的酶活力. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 雜化酶在催化環(huán)境變化下, 4種雜化酶的催化活性變化趨勢(shì)相近. Lip-hNF的最優(yōu)pH值為8.

圖6 不同反應(yīng)pH對(duì)雜化酶酶活的影響Fig.6 Effects of different pH on enzyme activity of hybrid enzymes

2.3 雜化脂肪酶包封率

根據(jù)公式（1）計(jì)算出雜化酶中游離脂肪酶的包封率如圖7 所示. 其中Ca/hNF的包封率為95.78%,大于其余3 種Lip-hNF, Mn/hNF中固定脂肪酶的含量要大于Zn/hNF, Cu/hNF的固定化效率最低為91.89%. 雜化酶的包封率根據(jù)金屬離子的不同, 包封率無(wú)顯著差異（P＜0.01）, 均大于90%, 體現(xiàn)出良好的固定化效率.

圖7 雜化脂肪酶包封率Fig.7 Encapsulation rate of hybrid lipases

2.4 雜化脂肪酶酶活測(cè)定

固定化酶會(huì)與底物接觸受到限制, 通常游離脂肪酶被固定化后活性會(huì)下降, 活性是評(píng)價(jià)固定化酶的一個(gè)重要指標(biāo). 結(jié)果如圖8所示, 雜化酶的水解活性均大于游離脂肪酶, 活性從高到低的順序依次為:Ca/hNF ＞Zn/hNF ＞Mn/hNF ＞Cu/hNF. 其中Ca/hNF的酶活為游離脂肪酶活性的187%, Zn/hNF的酶活為游離脂肪酶活性的148% , Mn/hNF的酶活為游離脂肪酶活性的137% , Cu/hNF的為游離脂肪酶活性的108%. 從生長(zhǎng)機(jī)理來(lái)講, 金屬離子能通過(guò)協(xié)調(diào)相互作用與酶分子形成復(fù)合物, 這是雜化酶形成的關(guān)鍵.不同金屬離子雜化酶活性增強(qiáng)的原因可以歸于較高的比表面積和二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變, 其中Ca2+作為生物體中一種重要的元素, 參與整個(gè)生命的新陳代謝.對(duì)于脂肪酶有激發(fā)作用, 使得酶分子更容易與底物接觸, 進(jìn)一步提高雜化酶的催化活性.

2.5 雜化脂肪酶催化性能及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

為了進(jìn)一步了解雜化酶的性質(zhì), 測(cè)定了游離脂肪酶和Ca/hNF、 Zn/hNF、 Mn/hNF、 Cu/hNF的動(dòng)力學(xué)參數(shù), 結(jié)果如表1所示.

Km值通常用于評(píng)估親和力. 表1 顯示游離脂肪酶的Km值小于雜化酶, 表明底物和脂肪酶之間的擴(kuò)散阻力較高, 從而導(dǎo)致雜化酶的Km增大. 其中Ca/hNF的Km要小于其它3 種Lip-hNF. 然而, 較高的Vmax表明雜化酶相對(duì)于游離脂肪酶具有較高的催化效率.Kcat/Km常用來(lái)衡量酶的催化效率, 被稱為特異性常數(shù), 能夠綜合反映酶對(duì)底物的親和力和催化能力［29］. 4 種Lip-hNF的反應(yīng)速率Kcat/Km從高到低的順序依次為: Ca/hNF ＞Zn/hNF ＞Mn/hNF ＞Cu/hNF. 與游離脂肪酶相比, 雜化酶的Vm/Km值高于游離脂肪酶, 說(shuō)明雜化酶的催化效率要強(qiáng)于游離脂肪酶, 雜化酶的Km值和催化效率與Li等［22］和Talbert等［33］制備的雜化納米花呈現(xiàn)相同的趨勢(shì), 固定化酶的Km大于游離脂肪酶, 但雜化酶的Kcat/Km高于游離脂肪酶, 這可能與脂肪酶納米花獨(dú)特的花狀結(jié)構(gòu)所具有的高比表面積有關(guān)［34］, 表明納米花狀的雜化酶使酶分子朝著有利于催化水解反應(yīng)速率的方向而改變.

表1 游離脂肪酶和雜化脂肪酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of free lipase and Lip-hNF

2.6 雜化脂肪酶耐受性

雜化酶對(duì)于變性劑耐受性如圖9所示, 對(duì)于甲醇的耐受性由大到小為: Ca/hNF ＞ Zn/hNF ＞ Mn/hNF ＞Cu/hNF; 對(duì)乙醇的耐受性由大到小為: Ca/hNF ＞Cu/hNF ＞ Mn/hNF ＞ Zn/hNF; 在尿素中的酶活均保持在90%以上, 對(duì)尿素的耐受性由大到小為Ca/hNF ＞Zn/hNF ＞ Cu/hNF ＞ Mn/hNF. 結(jié)果顯示, 雜化酶在變性劑中維持著良好的水解活性, 對(duì)于這3種變性劑的耐受性由高到低的排序?yàn)? 尿素 ＞ 乙醇 ＞ 甲醇, 在尿素中的水解活性顯著高于其余3種雜化酶（P＜0.01）.

圖9 雜化脂肪酶在不同變性劑下的耐受性Fig.9 Tolerance of hybrid lipases to different denaturing agents

2.7 雜化脂肪酶重復(fù)利用性

脂肪酶被開發(fā)利用, 良好的重復(fù)次數(shù)可以極大地降低使用成本, 擴(kuò)大在工業(yè)上的應(yīng)用, 雜化酶可通過(guò)離心的方法重復(fù)使用. 如圖10所示, 在重復(fù)使用3次后, 4種Lip-hNF的活性仍能保持在60%以上,具有良好的重復(fù)使用性.

圖10 雜化脂肪酶的重復(fù)利用性Fig.10 Reusability of hybrid lipases

制備的雜化酶催化活性與其他新型固定化酶方法的比較見表2. 與文獻(xiàn)報(bào)道的其它固定化酶方法相比, 本法制備出的雜化酶包封率高, 催化活性高,具有良好的重復(fù)性和耐受性.

表2 不同方法固定化酶催化性能比較Table 2 Comparison of catalytic performance of immobilized enzymes by different methods

3 結(jié)論

采用Ca、 Mn、 Zn、 Cu 4種金屬鹽對(duì)游離脂肪酶進(jìn)行固定化, 討論了反應(yīng)時(shí)間、 反應(yīng)溫度、 pH值對(duì)雜化酶水解活性的影響, 得到最優(yōu)反應(yīng)體系: 雜化酶在10 min, 40 ℃, pH=8時(shí)的反應(yīng)條件下, 催化水解活性最佳, 為游離脂肪酶催化活性的187%. 經(jīng)紅外光譜及電鏡的表征結(jié)果證明金屬鹽離子改變游離脂肪酶的結(jié)構(gòu)為片狀層級(jí), 增大了比表面積, 有效地提高脂肪酶催化水解活性. 雜化酶的催化活性從大到小的排序?yàn)? Ca＞Zn＞Mn＞Cu, 對(duì)其動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn), 4種Lip-hNF的反應(yīng)速率常數(shù)Kcat/Km大于游離脂肪酶, 表現(xiàn)出更高的催化效率. 雜化酶對(duì)甲醇、 乙醇、 尿素的耐受性和重復(fù)性的考察結(jié)果表明, 在4種Lip-hNF中Ca/hNF具有更高的耐受變性劑能力; 在重復(fù)使用3次后, 雜化酶的活性仍能保持在60%以上, 可以看出雜化納米花具有良好的重復(fù)使用性. 經(jīng)過(guò)4種金屬鹽修飾后脂肪酶的性能均得到有效改善, 其中Ca雜化酶因Ca2+良好的生物相容性對(duì)于脂肪酶催化水解性能的改善更佳. 我們制備的雜化納米花狀脂肪酶固定化方法簡(jiǎn)單, 綠色高效, 包封率高, 具有良好的應(yīng)用前景.