馮詩詩，惠 明*，楊林英，田 青，胡 軍

1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

2.鄭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450001

人體腸道菌群的穩(wěn)定是機(jī)體正常生理代謝和免疫體系的重要保障[1]，其中長雙歧桿菌是腸道中的一個(gè)重要菌群[2]，具有抵抗病原微生物，提高機(jī)體免疫力[3-4]，調(diào)節(jié)腸道微生物[5]，保護(hù)腸道屏障的完整性[6]，預(yù)防腹瀉、便秘、食物過敏等[7-8]功能，與機(jī)體健康密切相關(guān)。雙歧桿菌益生作用的主要機(jī)制是耐受胃酸和膽汁、可產(chǎn)生乳酸降低腸道pH值抑制致病菌的生長[9-10]、可降解膽固醇[11-13]等。此外，雙歧桿菌對腸道上皮細(xì)胞具有黏附性，能刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)[14]，以此來保護(hù)宿主，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化，競爭空間和營養(yǎng)來抵御病原微生物[15]、提高機(jī)體的抗腫瘤免疫能力、抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散、推進(jìn)抗PD-L1腫瘤免疫療法的療效[16]。目前，國內(nèi)對雙歧桿菌的研究大多都是未經(jīng)馴化的厭氧菌株，由于耐氧馴化較為復(fù)雜，且馴化過程漫長，對耐氧雙歧桿菌的研究相對較少。雙歧桿菌是嚴(yán)格的厭氧菌，日常保存和培養(yǎng)中菌株會(huì)與氧氣有不同程度的接觸，造成氧中毒，限制其進(jìn)一步的研究與應(yīng)用。對鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院胡軍實(shí)驗(yàn)室經(jīng)長期傳代保存的益生菌菌樣，通過16S rRNA測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分離鑒定菌種為長雙歧桿菌，將該菌株標(biāo)記為F16，用其發(fā)酵豆?jié){，發(fā)現(xiàn)比未馴化的長雙歧桿菌凝固豆?jié){所用時(shí)間更短，對其進(jìn)行穿刺培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌株只沿穿刺線生長且形成的穿刺線粗而散，表明該菌株對氧氣具有一定的耐受性，菌株其他性能未知，為探究耐氧性雙歧桿菌的益生性能，采用高效液相色譜法、比色法、平板計(jì)數(shù)法、模擬胃腸道環(huán)境等方法對F16的降膽固醇能力和耐受性能等益生價(jià)值進(jìn)行研究，為新一代益生性產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種來源：菌樣由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院胡軍實(shí)驗(yàn)室提供。

瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、檸檬酸氫二銨、葡萄糖、吐溫-80、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳(BC)等：天津市大茂化學(xué)試劑廠；Ezup柱式細(xì)菌基因DNA 抽提試劑盒、瓊脂糖、膽固醇、牛膽酸鈉等：生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶(BR)：源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1109B型超凈工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司；BK 5000型光學(xué)顯微鏡：奧特光學(xué)儀器有限公司；YQX-II厭氧培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；JY600D電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；PCR儀：上海儀濤生物有限公司；高效液相儀系統(tǒng)：株式會(huì)社島津制作所；紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種分離

取菌樣，稀釋涂布，待長出純菌株后，挑取單菌落劃線，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h(第1次活化時(shí)間較長，為5～7 d)，傳代至菌株形態(tài)穩(wěn)定，標(biāo)記為F16。

1.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察菌株的形態(tài)特征，并記錄。進(jìn)行革蘭氏染色，觀察結(jié)果。

1.3.3 生理生化鑒定

過氧化氫酶試驗(yàn)：使用3%～5%的過氧化氫溶液測定。

糖發(fā)酵試驗(yàn)：乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、核糖、硝酸鹽還原。與空白對照相比，若培養(yǎng)基保持原色，則表明菌株F16不能利用該糖，用“-”表示；若培養(yǎng)基變黃色，則表明菌株F16能分解該糖并產(chǎn)酸，用“+”表示。

果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶(F6PPK)測定：果糖-6-磷酸酮酶是雙歧桿菌屬的特征性酶，在已糖代謝中，能夠裂解果糖-6-磷酸，從而產(chǎn)生乙酸和乳酸。借用高頻聲波破壞雙歧桿菌細(xì)胞，使得果糖-6-磷酸酮酶暴露出來，然后加入底物果糖-6-磷酸及指示劑，用分光光度計(jì)觀察顏色變化可以初步鑒定雙歧桿菌。具體操作參照文獻(xiàn)[17]。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定

菌株F16基因組DNA的提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中說明書步驟進(jìn)行。利用PCR擴(kuò)增其16S rRNA基因片段[18]，設(shè)置一個(gè)空白對照，以此來判斷操作過程是否染菌。參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，獲得一條約1 500 bp的單一透明條帶，送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。

1.3.5 代謝產(chǎn)物乳酸含量測定

采用楊鈺昆等[20]優(yōu)化的高效液相色譜法，在該測定方法的基礎(chǔ)上，改用ZORBAX SB-C18色譜柱，以0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液作流動(dòng)相，測定發(fā)酵液中乳酸含量。

1.3.6 膽固醇降解試驗(yàn)

吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，分別加入無水乙醇和顯色劑，顯色后30～40 min，在560 nm處讀取吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[21]。將過濾除菌后的10.0 mg/mL的膽固醇溶液按1% 加入MRS培養(yǎng)基中，使膽固醇最終添加量為0.1 mg/mL，分別加入1%和5%的菌懸液，分別在培養(yǎng)48、72 h后測定膽固醇降解情況。具體測定方法參照文獻(xiàn)[22]。

1.3.7 耐酸性試驗(yàn)

取菌懸液0.1 mL，注入含有2 mL PBS的pH值分別為1、2、3、4的50 mL具塞比色管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，并分別于0、2、4、6、8 h測定OD600，每組重復(fù)測3次取平均值。

1.3.8 耐膽鹽試驗(yàn)

取菌懸液0.1 mL注入含0、1%、2%、3%牛膽酸鈉的液體培養(yǎng)基，吐溫-80含量為1.5%，分別于0、2、4、6、8 h測定OD600，每組重復(fù)測3次取平均值。

1.3.9 對人工胃腸液的耐受性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[22]中的方法配制人工胃液和腸液，等比例混合，以此來模擬胃腸道環(huán)境。將1 mL菌懸液與9 mL的混合液搖勻，37 ℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 h，分別于0 h和3 h取樣，稀釋涂布及培養(yǎng)，平板計(jì)數(shù)，計(jì)算其存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

菌株鏡檢結(jié)果如圖1所示。菌落邊緣整齊，表面凸起且光滑，不透明，呈乳白或灰白色。傳代2～3次后，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陽性菌，菌體呈棒槌狀排列、無芽孢，并且隨著傳代次數(shù)增加其逐漸呈現(xiàn)細(xì)絲狀。

圖1 F16菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果(放大100)

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

過氧化氫酶試驗(yàn)：過氧化氫溶液中不產(chǎn)氣泡，試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，表明菌株F16不產(chǎn)過氧化氫酶。

糖發(fā)酵試驗(yàn)：蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖試驗(yàn)呈陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陰性，表明菌株F16能夠分解利用蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖，并產(chǎn)酸。

果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶(F6PPK)測定：在試驗(yàn)最后添加含三氯化鐵的鹽酸后，體系變?yōu)榧t色，表明菌株F16為F6PPK陽性。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株F16的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳之后，將凝膠置于成像系統(tǒng)下觀察發(fā)現(xiàn)其目的菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500 bp左右處有單一且明亮的條帶，其空白對照則無，具體見圖2。

注：從左至右依次為DNA Marker D、空白對照、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

將F16菌株的16S rRNA基因檢測拼接序列輸入美國國家生物技術(shù)信息中心(National center for biotechnology information, NCBI)官網(wǎng)中的Nucleotide BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，再將比對結(jié)果通過MEGA軟件進(jìn)行F16菌株16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹建立(圖3)。結(jié)果表明與該序列相似度高的相關(guān)菌株均為雙歧桿菌屬，系統(tǒng)發(fā)育樹分析得出該菌與NR 117506.1(Bifidobacteriumlongumstrain KCTC 3128)和NR 044691.2(Bifidobacteriumlongumstrain ATCC 15707)處于同一分支上，同源性達(dá)99%以上，故親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌落、菌體、生理生化等特征，可初步確定該菌為長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)。

圖3 F16菌株16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 代謝產(chǎn)物乳酸含量測定結(jié)果

乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜檢測分析結(jié)果見圖4，由圖4可知，乳酸標(biāo)準(zhǔn)品在5.795 min處出峰。乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[23]，根據(jù)不同濃度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)品測得的峰面積結(jié)果制作乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線的橫坐標(biāo)是乳酸標(biāo)準(zhǔn)品含量(mg/mL)，縱坐標(biāo)是峰面積，回歸方程為y=126.740 0x-0.622 9，回歸系數(shù)(0.999)大于0.99，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，乳酸含量在0.05～1 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖4 乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

發(fā)酵液在5～6 min之間出現(xiàn)的峰面積為134 752；將數(shù)值代入乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，得出結(jié)果再乘以稀釋倍數(shù)(10倍)算得發(fā)酵液中乳酸含量為10.63 mg/mL。

2.5 膽固醇降解試驗(yàn)結(jié)果

以膽固醇含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，參照2.4中的繪制方法，制作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.430 1x+0.003 0，回歸系數(shù)(0.998)大于0.99，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

最初培養(yǎng)基中膽固醇添加量為0.1 mg/mL,由表1可知，48 h和72 h后其含量顯著降低，降解率分別為46%和73%，說明菌株有明顯降解膽固醇的作用，1%和5%接種量的樣品降解率相差較小，降解效果差異不顯著，說明少量菌株即可達(dá)到高效的降解。

表1 長雙歧桿菌降解膽固醇情況

2.6 耐酸能力

益生菌被機(jī)體攝入后，進(jìn)入胃腸道發(fā)揮作用，而胃液pH值通常在2以下，因此對菌株進(jìn)行耐酸性測試十分重要。由圖5可知，菌株F16活性由高到低的酸性環(huán)境依次為pH 4、pH 3、pH 2、pH 1，在pH 1、2、3、4的不同酸性環(huán)境中，2 h菌株活性分別下降了20.75%、17.50%、13.33%、4.27%，8 h菌株活性分別下降了36.70%、36.25%、22.35%、19.93%。菌株耐酸能力中等偏上。

圖5 長雙歧桿菌耐酸情況

2.7 耐膽鹽能力

由圖6可知，前6 h菌株F16活性上升相對較快，8 h在0、1%、2%、3%的膽鹽條件下菌株活性分別上升了72.89%、77.27%、95.31%、83.33%，說明膽鹽含量高的環(huán)境中菌株生長情況較好，兩者基本呈正相關(guān)。通過查閱文獻(xiàn)[24-25]發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)格厭氧的雙歧桿菌在高膽鹽條件下，生長曲線平緩并有下降趨勢，而菌株F16仍能正常增長，表明菌株對膽鹽的耐受能力較高。

圖6 長雙歧桿菌耐膽鹽情況

2.8 人工胃腸道耐受能力

模擬人胃腸道環(huán)境，僅有10-5和10-6的菌落數(shù)在30～300之間，分別是156(0 h)、125(3 h);113(0 h)、102(3 h)，其他梯度均不符合計(jì)數(shù)要求，故存活率參考這兩個(gè)梯度。10-5的存活率為80.13%，10-6的存活率為90.27%，取其平均值可得到菌株F16在胃腸道內(nèi)3 h存活率為85.20%。存活率較高，證明該菌株在人胃腸道內(nèi)可保持較強(qiáng)活性，能充分發(fā)揮益生效用。

3 結(jié)論

通過16S rRNA序列分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法鑒定菌株F16為長雙歧桿菌菌屬(Bifidobacteriumlongus)。益生菌的抑菌機(jī)制是通過產(chǎn)生有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)胃腸道環(huán)境，降低胃腸道內(nèi)的pH值，來抑制致病菌等的生長。長雙歧桿菌F16將碳水化合物發(fā)酵成乳酸，抑制致病菌的生長及活性，達(dá)到調(diào)節(jié)胃腸道微生物平衡的目的。采用高效液相色譜法測定了長雙歧桿菌F16的代謝產(chǎn)物乳酸含量為10.63 mg/mL，乳酸產(chǎn)量較為可觀，具有較好的抑菌性。采用比色法測定長雙歧桿菌F16對酸度和牛膽酸鈉的耐受性，在不同酸度環(huán)境下，8 h菌株活性分別下降了36.70%(pH 4)、36.25%(pH 3)、22.35%(pH 2)、19.93%(pH 1)，菌株生長所受影響較?。徊煌哪扄}含量(0、1%、2%、3%)條件下，8 h菌株活性分別上升了72.89%、77.27%、95.31%、83.33%，說明膽鹽能在一定程度上協(xié)同該菌株的生長。該菌株的耐酸能力中等偏上、耐膽鹽能力極好。

比色法測定長雙歧桿菌F16的降膽固醇能力，膽固醇的最佳測定時(shí)間是溶液顯色后30～40 min，最大吸收波長是560 nm，菌株對膽固醇的降解率較高(46%～75%)，證明菌株降解膽固醇的能力較強(qiáng)，72 h的降解率顯著高于48 h。此試驗(yàn)為體外試驗(yàn)，在碳源、氮源充足，溫度、pH值等條件適宜的基礎(chǔ)上，降解膽固醇效果非常顯著；但將菌株制成制劑等益生產(chǎn)品，進(jìn)入人體后，由于生產(chǎn)和儲存過程中的條件、周圍環(huán)境及胃腸道環(huán)境的不同可能會(huì)對益生效果產(chǎn)生影響。模擬人胃腸道環(huán)境，菌落計(jì)數(shù)法測得菌株在模擬環(huán)境中3 h的存活率為85.20%。綜上所述，耐氧長雙歧桿菌F16具有良好的耐受性能、降膽固醇能力以及在胃腸道環(huán)境中具有較高活性，是1株優(yōu)秀的益生菌，對于開發(fā)益生菌制品具有重要應(yīng)用價(jià)值。