韓紅宇，王 帥，王天元，陳昱筱，秦 紅，李 振，龐全海*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省忻州市忻府區(qū)畜牧獸醫(yī)中心，山西 忻州 034000；3.山西省柳林縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西 柳林 033300；4.山西省陽曲縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山西 陽曲 030100；5.山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 榆次 030619)

眾所周知，維生素D的主要功用是促進(jìn)小腸黏膜細(xì)胞對(duì)鈣和磷的吸收、調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷代謝，并參與細(xì)胞的增殖和分化、機(jī)體免疫應(yīng)答、機(jī)體的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等一系列過程[1-2]。近年有人提出了維生素D信號(hào)在腸道炎性疾病免疫中的作用[3-4]，腸道NF-κB信號(hào)通路已成為胃腸免疫相關(guān)信號(hào)通路研究的熱點(diǎn)[5-6]，在腸道免疫及抗微生物感染中起著極為重要的作用[7]。但是，這些研究多限于人或水生動(dòng)物[8]，而在其他動(dòng)物的研究報(bào)道較少?，F(xiàn)有日糧中添加維生素D3對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、腸道健康影響的報(bào)道[9-10]，但尚未見有在微貯飼料中添加維生素D對(duì)于綿羊腸道形態(tài)及NF-κB信號(hào)通路影響的報(bào)道。因此，本研究旨在通過在微貯豆秸飼糧中添加不同水平維生素D探討其對(duì)綿羊腸道形態(tài)和抗氧化功能以及腸道NF-κB信號(hào)通路的影響，闡明其對(duì)綿羊腸道健康的影響機(jī)制，進(jìn)而為維生素D在豆秸飼料和綿羊生產(chǎn)中的合理利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25只體質(zhì)量相似(18.51～22.95 kg)、臨床健康的3月齡杜泊羊(♂)×小尾寒羊(♀)的F1公羔25只(由山西省柳林縣匯源新盛養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供)，將羊隨機(jī)分為5組，每組5只。

1.2 微貯豆秸按照參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行制作。

1.3 試驗(yàn)飼糧所有處理組均飼喂精料+微貯豆秸，對(duì)照組的VD3添加量為0，試驗(yàn)組的VD3添加量分別為300，600，900，1 200 IU/kg。各處理組基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)水平見表1，2。

表1 基礎(chǔ)飼糧配方及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

表2 試驗(yàn)分組及VD3添加量

1.4 主要試劑RNA提取試劑TRIzol(購自大連TaKaRa公司)；PCR引物(購自華大基因測(cè)序公司)；CAT測(cè)定試劑盒、T-SOD測(cè)定試劑盒、GSH-Px測(cè)定試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒(均購自南京建成生物工程有限公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自加拿大abm公司)等。

1.5 主要儀器設(shè)備KD-BM生物組織包埋機(jī)(浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠)；DMLB光學(xué)顯微鏡(美國Leica公司)；漩渦振蕩儀(海門市其林貝爾儀器有限公司)；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Forma公司)；普通PCR儀(美國Bio-Rad公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.6 腸道形態(tài)觀察試驗(yàn)期最后1 d采集綿羊十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸中部腸段(1 cm×2 cm)放入4%多聚甲醛中固定備用，之后鏡檢觀察其絨毛高度、隱窩深度、并計(jì)算絨隱比。

1.7 腸道抗氧化性性能測(cè)定在試驗(yàn)期最后1 d，每組隨機(jī)挑選4只綿羊進(jìn)行屠宰取樣，分別采集綿羊十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸，放入液氮中備用。用南京建成生物工程有限公司試劑盒測(cè)定CAT、T-SOD、GSH-Px、MDA的活性。

1.8 腸道NF-κB通路中相關(guān)因子測(cè)定從NCBI中選取試驗(yàn)所需的基因及內(nèi)參18S RNA的mRNA序列，采用Pick Primer設(shè)計(jì)引物。所有引物由上海生工合成，引物信息見表3。

表3 PCR引物序列及相關(guān)信息

提取綿羊組織總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按Abm公司5×All-In-One RT MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)進(jìn)行熒光定量PCR，計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果。本試驗(yàn)利用2-△△Ct法計(jì)算不同基因在腸道中的表達(dá)量。

1.9 結(jié)果處理試驗(yàn)結(jié)束后，先將數(shù)據(jù)采用Microsoft Office 2013中的Excel進(jìn)行整理，然后用SPSS 17.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 維生素D對(duì)綿羊腸道形態(tài)的影響由表4可知，VD3添加劑量為300 ～1 200 IU/kg時(shí)均可極顯著升高十二指腸絨毛高度(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg時(shí)，差異最高；添加量為300～900 IU/kg時(shí)，可極顯著降低隱窩深度(P<0.01)，而添加量為1 200 IU/kg時(shí)，這種差異不再極顯著(P<0.05)；各試驗(yàn)組均可極顯著升高十二指腸絨隱比(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg時(shí)，差異最高(圖1)。

A.對(duì)照組；B～E.試驗(yàn)組(VD3添加劑量分別為300，600，900，1 200 IU/kg)

表4 微貯豆秸飼料中添加維生素D對(duì)綿羊十二指腸形態(tài)的影響

由表5可知，VD3添加量為300，600，900 IU/kg時(shí)可極顯著升高綿羊空腸絨毛高度(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg時(shí)差異最高；而添加量為1 200 IU/kg時(shí)無顯著性差異(P>0.05)；添加量為600～1 200 IU/kg時(shí)，可極顯著降低空腸隱窩深度(P<0.01)；各試驗(yàn)組均可極顯著升高絨隱比(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg時(shí)差異最高(圖2)。

A.對(duì)照組；B～E.試驗(yàn)組(VD3添加劑量分別為300，600，900，1 200 IU/kg)

表5 微貯豆秸飼料中添加維生素D對(duì)綿羊空腸形態(tài)的影響

由表6可知，添加300，600，900 IU/kg VD3可極顯著升高回腸絨毛高度且降低隱窩深度(P<0.01)；而添加量為1 200 IU/kg時(shí)，差異不顯著(P>0.05)；各試驗(yàn)組均可極顯著升高回腸絨隱比(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg時(shí)差異最高(圖3)。

表6 微貯豆秸飼料中添加維生素D對(duì)綿羊回腸形態(tài)的影響

A.對(duì)照組；B～E.試驗(yàn)組(VD3添加劑量分別為300，600，900，1 200 IU/kg)

由表7可知，添加300，600，1 200 IU/kg VD3可極顯著升高結(jié)腸絨毛高度(P<0.01)；各試驗(yàn)組均可極顯著降低結(jié)腸隱窩深度(P<0.01)；添加300～900 IU/kg VD3可極顯著升高綿羊結(jié)腸絨隱比；而添加量為1 200 IU/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

表7 微貯豆秸飼料中添加維生素D對(duì)綿羊結(jié)腸形態(tài)的影響

A.對(duì)照組；B～E.試驗(yàn)組(VD3添加劑量分別為300，600，900，1 200 IU/kg)

2.2 維生素D對(duì)綿羊腸道抗氧化性的影響由表8可知，添加300，900，1 200 IU/kg VD3可顯著升高綿羊十二指腸CAT(P<0.05)活性；添加300，600，1 200 IU/kg VD3可極顯著升高T-SOD(P<0.01)活性；各試驗(yàn)組均可極顯著升高GSH-Px活性，顯著降低MDA(P<0.05)活性，且添加量為600 IU/kg時(shí)差異最大。

表8 微貯豆秸飼料中添加維生素D對(duì)綿羊十二指腸抗氧化性的影響

由表9可知，在空腸中，各試驗(yàn)組均可極顯著升高CAT、T-SOD、GSH-Px(P<0.01)活性，且添加量為600 IU/kg時(shí)差異最大；添加300，600，900 IU/kg VD3可顯著降低MDA(P<0.05)活性，而添加量為1 200 IU/kg VD3時(shí)，顯著升高M(jìn)DA(P<0.05)活性。

表9 微貯豆秸飼料中添加維生素D對(duì)綿羊空腸抗氧化性的影響

由表10可知，在回腸中，各試驗(yàn)組添加VD3均可極顯著升高CAT、T-SOD、GSH-Px(P<0.01)活性，且添加量為600 IU/kg時(shí)差異最大；添加量為300，600，900 IU/kg VD3時(shí)可極顯著降低MDA(P<0.01)活性，而添加量為1 200 IU/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。

表10 微貯豆秸飼料中添加維生素D對(duì)綿羊回腸抗氧化性的影響

由表11可知，在結(jié)腸中，添加300，600，900 IU/kg VD3可極顯著升高腸道CAT(P<0.01)活性；添加600，900，1 200 IU/kg VD3可極顯著升高T-SOD(P<0.01)活性，且添加量為600 IU/kg時(shí)，差異最顯著；各試驗(yàn)組均可極顯著升高GSH-Px(P<0.01)活性，顯著降低MDA(P<0.05)活性。

表11 微貯豆秸飼料中添加維生素D對(duì)綿羊結(jié)腸抗氧化性的影響

2.3 維生素D對(duì)綿羊腸道m(xù)RNA表達(dá)量及NF-κB信號(hào)通路的影響由圖5可知，添加300，600，900 IU/kg VD3可極顯著降低綿羊各腸道TLR4 mRNA表達(dá)量(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg差異最顯著；添加1 200 IU/kg VD3對(duì)結(jié)腸TLR4 mRNA表達(dá)量的影響差異不顯著(P>0.05)。

1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.結(jié)腸。*.P<0.05,**.P<0.01。下同

由圖6可知，添加300，600，900 IU/kg VD3可極顯著降低綿羊各腸道MyD88 mRNA表達(dá)量(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg差異最顯著；添加1 200 IU/kg VD3對(duì)十二指腸、空腸MyD88 mRNA表達(dá)量的影響差異不顯著(P>0.05)。

1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.結(jié)腸

由圖7可知，添加300，600，900 IU/kg VD3可極顯著降低綿羊各腸道TRAF6 mRNA表達(dá)量(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg差異最顯著；添加1 200 IU/kg VD3對(duì)十二指腸TRAF6 mRNA表達(dá)量的影響差異不顯著(P>0.05)。

1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.結(jié)腸

由圖8可知，添加300，600，900 IU/kg VD3可極顯著降低綿羊各腸道IL-1β mRNA表達(dá)量(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg差異最顯著；添加1 200 IU/kg VD3十二指腸IL-1β mRNA表達(dá)量的影響差異不顯著(P>0.05)。

1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.結(jié)腸

由圖9可知，添加300，600，900 IU/kg VD3可極顯著降低綿羊腸道VDR mRNA表達(dá)量(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg差異最顯著；添加1 200 IU/kg VD3對(duì)回腸VDR mRNA表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.結(jié)腸

由圖10可知，添加300，600，900 IU/kg VD3可極顯著降低綿羊腸道NF-κB1 mRNA表達(dá)量(P<0.01)，且添加量為600 IU/kg差異最顯著；添加1 200 IU/kg VD3對(duì)十二指腸、回腸、結(jié)腸NF-κB1 mRNA表達(dá)量的影響差異不顯著(P>0.05)。

1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.結(jié)腸

3 討論

3.1 微貯飼料中添加維生素D對(duì)綿羊腸道形態(tài)的影響本課題組前期的研究表明，微貯處理豆秸可以顯著提高綿羊?qū)τ袡C(jī)物、粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的表觀消化率，提高腸道抗氧化性[11-12]。本試驗(yàn)研究表明，日糧中適量添加維生素D3可改善綿羊腸道形態(tài)，飼糧中添加300～900 IU/kg VD3可顯著或極顯著升高綿羊各腸段的絨毛高度并且降低隱窩深度，表明微貯豆秸中添加維生素D可以有效改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、提高腸道消化吸收能力和免疫力。這與下列相關(guān)研究一致，CHOU等[13]研究表明，日糧中持續(xù)添加維生素D3可提高肉雞十二指腸和空腸的絨毛長(zhǎng)度，降低隱窩深度，增加絨隱比；張振祥[14]研究表明，日糧中添加250 IU/kg VD3時(shí)，可顯著提高斷奶仔豬第7天絨毛高度。研究表明，維生素D在維持腸道屏障的完整性方面具有一定作用[15]，腸上皮位于腸道基底膜上黏膜表面，構(gòu)成腸屏障，在管腔表面，杯狀細(xì)胞可分泌一層高度糖基化的黏蛋白進(jìn)一步促進(jìn)屏障的形成。維生素D可以提高腸道黏膜上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表達(dá)[16]。此外，VDR信號(hào)可通過肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)參與控制腸道屏障的完整性[17]。因此，適宜濃度的維生素D可通過提高各種緊密連接蛋白的表達(dá)而改善動(dòng)物腸道形態(tài)。

3.2 微貯飼料中添加維生素D對(duì)綿羊腸道抗氧化性的影響腸道發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí)，抗氧化防御系統(tǒng)無法從體內(nèi)去除多余的ROS。彭峰[18]研究表明，1,25(OH)2D3可能通過VDR信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激。李向等[19]研究表明飼料中添加維生素D3可以顯著提高黑鱸肝臟中SOD、CAT活性和總抗氧化能力,顯著降低血清中AST活力；王麗麗等[20]也認(rèn)為，基礎(chǔ)日糧中添加VD3，隨著添加量的升高，腸道T-SOD活力呈先上升后下降趨勢(shì)，MDA含量呈下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，日糧中添加300～900 IU/kg VD3可顯著提高各腸段CAT、T-SOD和GSH-Px活性，降低各腸段中MDA含量，表明微貯豆秸中添加適量維生素D能夠提高其腸道抗氧化能力，且維生素D添加量為600 IU/kg時(shí)達(dá)峰值區(qū)。這與前人研究結(jié)果相似。機(jī)體通過新陳代謝不斷地產(chǎn)生能量以供機(jī)體使用，而幫助能量轉(zhuǎn)換的自由基也由此產(chǎn)生[21]。一方面自由基能夠幫助能量轉(zhuǎn)換，另一方面失去了控制的自由基也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害。當(dāng)自由基失去控制時(shí)，體內(nèi)的抗氧化酶便會(huì)清除自由基以維持機(jī)體的正常生理活動(dòng)[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，微貯飼料中添加適宜濃度VD3后，CAT、T-SOD和GSH-Px活性均有所升高，MDA含量有不同程度的降低。這可能是因?yàn)閂D3在代謝過程中，產(chǎn)生了大量氧自由基，進(jìn)而提高了腸道的抗氧化能力[23]。

3.3 維生素D與綿羊腸道NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系NF-κB是調(diào)節(jié)涉及炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵基因之一，它誘導(dǎo)了各種炎癥標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄，并通過一系列炎癥細(xì)胞因子和趨化因子mRNA的表達(dá)控制最終的免疫反應(yīng)。NF-κB通常以p50、p60結(jié)合形成的異二聚體形式存在。在細(xì)胞質(zhì)中，與NF-κB抑制蛋白(IKB)結(jié)合，并以異寡聚物的形式保持非活性狀態(tài)[24]。TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路是作為關(guān)聯(lián)炎性反應(yīng)的重要通路之一，它的激活可誘導(dǎo)下游炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。研究表明，TLR4通過白細(xì)胞介素-1(toll interleukin-1 receptor domain,TIR)受體結(jié)構(gòu)域，利用TIR受體結(jié)構(gòu)域接頭蛋白、MyD88、IL-1R相關(guān)激酶、TRAF6等，誘導(dǎo)通路下游NF-κB的活化，活化的NF-κB暴露出核定位序列，從而進(jìn)入核內(nèi)與DNA特定位點(diǎn)結(jié)合，產(chǎn)生并釋放細(xì)胞因子，形成炎癥反應(yīng)[25]。SHEN等[26]研究認(rèn)為，黃芩苷可以通過調(diào)節(jié)IKK/IKB/NF-κB 信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白顯著抑制氧化應(yīng)激所致潰瘍性腸炎的腸道炎癥；MOHAMED等[27]研究表明輔酶Q10可以通過抑制NF-κB/TGF-β/MMP-9通路弱化放射性腸病引起的炎癥和纖維變性而維持輻射暴露后腸黏膜的完整性，證明輔酶Q10通過抑制NF-κB弱化輻射誘導(dǎo)的腸炎；PISTOL等[28]研究證明日糧中含有葡萄籽活性物質(zhì)可以通過抑制MAPKs和 NF-κB信號(hào)通路改善右旋糖酐誘導(dǎo)的豬結(jié)腸炎的腸道炎癥。亦有研究表明，VD3可通過改變NF-κB炎性體途徑來減弱小鼠牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙周炎[29]。已經(jīng)證明，1,25(OH)2D3能夠調(diào)節(jié)NF-kB信號(hào)通路，從而抑制炎癥反應(yīng)。1,25-(OH)2D3通過與VDR結(jié)合，增加抑制蛋白IκBa的mRNA表達(dá)及減少其磷酸化等途徑來抑制NF-κB信號(hào)通路[30]。除此經(jīng)典途徑外，1,25-(OH)2D3還通過調(diào)節(jié)NF-κB上游的其他因子對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。本試驗(yàn)結(jié)果表明，微貯飼料中添加300，600,900 IU/kg VD3均可極顯著降低TLR4、MyD88、NF-κB以及通路下游炎癥因子TRAF6、IL-1β、NF-κB1、VDR mRNA的表達(dá)量，并成劑量依賴關(guān)系，因此，日糧中添加適量VD3可抑制綿羊腸道炎性反應(yīng)的發(fā)生。